蟾蜍皮水提物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：惡性腫瘤已成為危害人類健康的頭號(hào)病癥之一，常規(guī)的化療、放療及手術(shù)治療對(duì)于控制大多數(shù)的癌癥并不理想。腫瘤患者接受放療、化療殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，由于多數(shù)抗腫瘤藥物缺乏選擇作用，對(duì)正常機(jī)體也有相當(dāng)大的損傷，導(dǎo)致骨髓造血功能抑制、消化道反應(yīng)、肝臟及腎臟等組織的損害、免疫功能下降等。中藥配合放、化療不但可以減輕其副作用，對(duì)腫瘤的療效也有明顯提高。單純的局部客觀癥狀緩解并不能全面反映中醫(yī)藥的療效，帶瘤生存，全身治療，改善癥狀，提高生命質(zhì)

2、量是中醫(yī)藥抗癌的特色所在。因此對(duì)天然生物及植物藥物有效成分的提取作為新的防癌劑，已成為當(dāng)今科研工作者們最感興趣的研究課題。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是探討蟾蜍皮水提物的體外抗腫瘤作用。中藥抗腫瘤的作用機(jī)制是復(fù)雜的，不管是單味中藥還是復(fù)方制劑，都含有多種成份，因此其作用不是單一的，它們可能具有多方面的作用。如何從多層次、多學(xué)科對(duì)中藥抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行客觀、定性、定量的研究，以進(jìn)一步揭示其奧秘，尚待中醫(yī)藥科學(xué)工作者的不斷努力。相信，以數(shù)千年中醫(yī)藥理

3、論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代藥物理論和生物技術(shù)，中藥的抗腫瘤作用機(jī)制研究和臨床應(yīng)用將會(huì)有很大的發(fā)展。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌細(xì)胞SMMC-7721于含10％新生牛血清、100U/ml青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)培養(yǎng)液中，在37°C、5％CO2、飽和濕度條件下，于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 2．MTT比色實(shí)驗(yàn)：選擇在對(duì)數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，其中設(shè)空白對(duì)照組不加受試細(xì)胞。培

4、養(yǎng)24小時(shí)后，藥物組加入不同濃度的蟾皮水提物，陰性對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，于加藥后第4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)加入MTT檢測，求出OD值。 (1)Y軸為細(xì)胞存活率，X軸為測定時(shí)間，制作4-72小時(shí)的細(xì)胞生長曲線。 (2)利用公式計(jì)算細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率。 (3)通過EXCEL畫圖法做趨勢線來求24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)IC50值。 3．集

5、落形成實(shí)驗(yàn)：收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于六孔板，200個(gè)細(xì)胞/孔，通過兩種方法檢測集落形成的情況。設(shè)藥物組，加入低、中、高濃度的藥物。陰性對(duì)照組，加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。檢測藥物作用于肝癌細(xì)胞48小時(shí)后的集落形成情況。 4．轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)：藥物作用細(xì)胞24小時(shí)后，轉(zhuǎn)入小室內(nèi)，CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，將小室取出，通過染色、脫水等步驟，將小室底部的膜沿壁切下，中性樹膠封片，在光鏡下，每個(gè)膜分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，求得單個(gè)視野

6、的平均穿膜細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果： 1．MTT結(jié)果 (1)增殖抑制率結(jié)果：藥物濃度為0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.25mg/ml時(shí)，作用24小時(shí)后，對(duì)肝癌細(xì)增殖抑制率為13％、20％、53％；作用48小時(shí)后，抑制率分別為22％、37％、68％；作用72小時(shí)后，抑制率為58％、75％、82％。與陰性對(duì)照組組相比，效果顯著(P<0.05)。 (2)生長曲線結(jié)果：生長曲線顯示藥物組細(xì)胞生長緩慢。

7、 (3)(IC50)值：藥物作用于肝癌細(xì)胞24小時(shí)的(IC50)值為0.2176mg/ml：48小時(shí)為0.0655mg/ml；72小時(shí)為0.0237mg/ml。 2．集落形成率的測定結(jié)果：0.005mg／ml藥物作用48小時(shí)后，去含藥培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)6天，其集落形成率為12.4％。常規(guī)培養(yǎng)5天后，加入不同濃度的藥物作用48h后去藥物，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)3天，其集落形成率為14.3％，與對(duì)照相比其集落形成率和集落形成抑制率有顯著