他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、一、研究背景20世紀80年代以來，肝移植技術(shù)作為治療終末期肝病的有效手段迅速發(fā)展。近年來，越來越多的學者贊成肝臟移植術(shù)是治療無肝外轉(zhuǎn)移的肝臟惡性腫瘤患者的一個有效治療方法。肝癌作為肝移植的一個適應證，居有重要地位。 Scharschmidt于80年代初統(tǒng)計世界上最大的4肝移植個中心，共540例，肝惡性腫瘤占139例，居第二位，僅次于肝硬化。截至2005年1月，我國累計施行肝移植手術(shù)已超過5000例，其中肝癌肝移植約占40％左右。

2、隨著肝移植數(shù)量的增加及經(jīng)驗的積累，肝癌肝移植的問題也逐漸成為研究的熱點。 近年肝癌肝移植取得了較好的臨床效果，其治療肝臟惡性腫瘤的療效等同于或優(yōu)于肝切除術(shù)。Cherqui等研究顯示即使癌灶＞5cm的患者，移植術(shù)后1、3年無癌生存率與小肝癌組移植術(shù)后生存率相近。Bismuth于1993年報告60例肝硬化肝癌，分肝切除與肝移植組，3年存活率雖相似(50％～47％)，但總的無轉(zhuǎn)移存活率移植組為46％，切除術(shù)僅27％(P＜0.05)，而

3、在早期小肝癌(癌塊1～2個，直徑≤3cm)則無轉(zhuǎn)移存活率移植組為83％，切除組僅18％，P＜0.001，差異極為顯著。 肝癌肝移植術(shù)后免疫抑制方案是目前全球移植界關(guān)注的問題。90年代以來，國內(nèi)外在肝臟移植免疫抑制劑的應用已形成以CsA或FK506為主，聯(lián)合硫唑嘌呤和強的松的三聯(lián)用藥規(guī)范。FK506、CsA作為器官移植術(shù)后基本的免疫抑制劑，其對肝癌生長、復發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，一直困擾著臨床肝移植界醫(yī)生。 FK506、CsA為鈣

4、神經(jīng)素抑制劑，免疫抑制作用的靶細胞主要是T細胞，它們分別與T淋巴細胞內(nèi)的相應受體FKBP(FK506bindingprotein)、環(huán)孢素親和素(cyclophilin，Cyp)結(jié)合形成的復合體，與胞漿內(nèi)的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止NF-ATC的核內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，進一步抑制IL-2基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制T細胞的活動過程，是其發(fā)揮免疫抑制效應的根本原因。 FK506、CsA對肝癌影響多為臨床觀察，對體外肝癌細胞的影響及其機制探

5、討的研究較少。我們以HepG-2肝癌細胞為研究對象，通過不同濃度的FK506、CsA作用不同時間，研究對肝癌細胞生長、細胞凋亡、增殖、細胞周期變化及細胞轉(zhuǎn)移能力，應用基因芯片技術(shù)和熒光PCR方法，從基因水平探討影向的機制。 二、本課題的研究方案1.MTT比色法觀察二者對HepG-2肝癌細胞生長的影響。 2.應用流式細胞技術(shù)研究二者對HepG-2肝癌細胞增殖、凋亡、細胞周期變化的影響。 3.應用細胞浸潤實驗觀察肝癌

6、細胞浸潤能力變化。 4.應用基因芯片技術(shù)篩選FK506、CsA影響的基因，從基因水平探討影響的機制。 5.熒光PCR方法進一步探討影響細胞轉(zhuǎn)移的基因在不同濃度下對細胞轉(zhuǎn)移能力影響。 第一部分他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞生長的影響 目的：觀察不同濃度的他克莫司與環(huán)孢素A對肝癌的增殖、凋亡、細胞周期的影響。 方法：1.噻唑藍(MTT)比色法細胞生長實驗FK506濃度分別為1、5、10、50

7、、100、500μg/L，CsA濃度設(shè)為5、10、50、100、500、1000μg/L。同時設(shè)無藥對照組。分別于加藥第24、48、72h取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5g/L)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，微量振蕩器振蕩5min，用全自動酶標儀檢測波長570nm時的吸光度值。 32.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、PCNA、細胞周期。 結(jié)果：1.FK506作用48h、72h肝癌

8、細胞增殖能力受到明顯抑制，當濃度大于100μg/L，F(xiàn)K506對肝癌細胞抑制作用不明顯。 2.CsA處理48h、72h后肝癌細胞增殖能力明顯受到抑制。3.FK506在1-50μg/L及CsA在10-500μg/L，作用48-72h，凋亡率明顯增加，隨濃度增加，凋亡率增加，呈濃度依賴依賴關(guān)系，超過一定該濃度時，則出現(xiàn)凋亡率減低。 4.FK506在1-50μg/L對HepG-2細胞作用48h，細胞周期S期縮短和G1/G0期延

9、長，對細胞周期影響主要為阻滯于G1/G0期。CsA對細胞周期無影響。 5.FK506在1-50μg/L及CsA在10-500μg/LPCNA表達顯著減低。 第二部分基因芯片研究他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞基因的影響目的：應用基因芯片技術(shù)研究他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞基因的影響。 方法：1.實驗分組實驗組1：CsA為300μg/L，實驗組2：K506設(shè)為20μg/L，未加藥物者為對照組。H

10、epG-2細胞分別經(jīng)過處理48h后檢測取細胞標本行基因芯片。 2.基因芯片在深圳微芯公司實驗中心檢測。具體方法如下：總RNA提取、探針標記、芯片雜交、芯片掃描、圖像結(jié)果分析、數(shù)據(jù)處理、報表生成。 結(jié)果：1.在CsA組中具有比較明顯的功能類別特征的基因變化是蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達下調(diào)，提示蛋白質(zhì)合成受到抑制； 2.在FK506組中比較突出的表達變化基因類型為與細胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實驗組樣品細胞存在細

11、胞增殖的抑制以及細胞凋亡的增加。 第三部分他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞的浸潤能力影響目的：探討他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細胞的浸潤能力影響。 方法：1.以HepG-2肝癌細胞為研究對象，F(xiàn)K506濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/L，CsA濃度為5、10、50、100、300、500μg/L，每一濃度各設(shè)3個復孔，同時設(shè)無藥對照組3孔，經(jīng)48h處理后行熒光光定量PCR的檢測。

12、2.細胞浸潤實驗FK506和CsA處理48h的細胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18-24h；PBS洗滌細胞2次，0.25％胰酶消化后，收集懸浮細胞，使細胞數(shù)達到0.25-1.0×106/ml；取100ul細胞懸液加到浸潤膜上，37℃孵育30分鐘；每孔加入1：75配好的CyQuantGR染色劑50ul，室溫孵育15分鐘，96孔板及浸潤膜取去，行共聚焦顯微鏡檢測，測定平均熒光強度。 3.熒光光定量PCR的檢測：設(shè)計引物和探針、

13、細胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應、熒光定量PCR反應。 結(jié)果：1.細胞浸潤實驗顯示：FK506在1-20μg/L及CsA在5-300μg/L作用48h，肝癌細胞熒光強度與對照組無明顯變化，超過上述濃度范圍肝癌細胞熒光強度較對照組明顯增強。 2.熒光PCR檢測：FK506在1-20μg/L，ICAM、MMP基因拷貝數(shù)與對照組無明顯差別，F(xiàn)K506濃度超過50μg/L表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)明顯增加，CsA與FK506表現(xiàn)為類似的反應。

14、 全文結(jié)論1.FK506、CsA對HepG-2肝癌細胞有生長抑制作用，使細胞增殖能力降低，在一定濃度和作用的時間下表現(xiàn)為促細胞凋亡作用。 2.FK506使細胞周期阻滯于G0/G1期，CsA對細胞周期無影響。 3.在CsA組中具有比較明顯的功能類別特征的表達變化基因主要包括與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達下調(diào)；在FK506組中比較突出的表達變化基因類型為與細胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實驗組樣品細胞存在細胞增殖的抑制