siRNA抑制CNN2表達對肝癌細胞生物學行為及裸鼠成瘤的影響.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNN2 siRNA的肝癌細胞株，用以觀察CNN2蛋白在表達沉默時對細胞生物學行為和裸鼠成瘤的影響。
　　方法：(1)將插入有CNN2 siRNA的慢病毒以及空載慢病毒LV3分別轉(zhuǎn)染SK-hep-1肝癌細胞，通過嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的“基因表達下調(diào)”細胞模型。Quantitative Real Time-PCR(qRT-PCR)和Western-blot法分別觀察分析轉(zhuǎn)染前后目的基因CNN2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的

2、表達變化。(2)通過Transwell實驗檢測細胞的遷移能力和侵襲能力的改變；MTT實驗檢測細胞增殖能力，觀察轉(zhuǎn)染細胞株與對照組細胞增殖能力的差異；流式細胞儀檢測細胞周期，觀察抑制CNN2表達對細胞周期的影響。(3)構(gòu)建SK-hep-1-siRNA，SK-hep-1-LV3，SK-hep-1三種細胞株的裸鼠皮下成瘤模型，每組12只裸鼠，雌雄各半。每日觀察裸鼠生活情況，待腫瘤長出后，每周測一次瘤體積，稱裸鼠體重。第4周處死裸鼠，取瘤體測體

3、積，稱重，解剖裸鼠觀察是否有腫瘤轉(zhuǎn)移。瘤組織石蠟包埋切片，HE染色進行病理觀察，TUNEL法檢測細胞凋亡，免疫組織化學檢測CNN2表達，磷酸化MEK，磷酸化ERK，磷酸化 AKT以及MEK，ERK，AKT蛋白表達。
　　結(jié)果：(1) SK-hep-1-siRNA細胞株及空載SK-hep-1-LV3細胞株在慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后，帶有綠色熒光，證實轉(zhuǎn)染成功，用2μg/mL嘌呤霉素篩選72 h后，在熒光顯微鏡下觀察，細胞100％帶有綠色

4、熒光，說明已將未轉(zhuǎn)染成功的肝癌細胞清除，以及成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SK-hep-1-siRNA和SK-hep-1-LV3細胞株。qRT-PCR、Western-blot顯示SK-hep-1-siRNA細胞株中目的基因CNN2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達均較SK-hep-1-LV3細胞株和未轉(zhuǎn)染細胞株降低(P<0.001)，轉(zhuǎn)錄水平CNN2表達抑制率約為68.3%，翻譯水平CNN2表達抑制率約為63.9%。(2)對三種細胞株的觀察表明，CN

5、N2表達沉默能抑制SK-hep-1細胞的增殖，使細胞周期阻滯在S期(P<0.01)，并使遷移運動(P<0.01)和侵襲能力降低(P<0.001)。(3)成功構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型。相比于SK-hep-1-LV3裸鼠成瘤組和SK-hep-1裸鼠成瘤組，SK-hep-1-siRNA裸鼠成瘤組腫瘤生長速度較慢，瘤體較小，成瘤率降低，4周后剝離瘤組織測得瘤體重量較輕，三組裸鼠瘤體積差異與重量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。所有組別的裸鼠均

6、未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，裸鼠重量三組相當，無顯著性差異。HE染色結(jié)果顯示，三組裸鼠瘤組織均呈現(xiàn)典型的腫瘤組織特征，即細胞核大，染色深，細胞排列緊密。TUNEL法測凋亡結(jié)果顯示三組瘤組織均未出現(xiàn)細胞凋亡的情況。SK-hep-1-siRNA組瘤組織CNN2、磷酸化MEK、磷酸化ERK表達下調(diào)，與陰性對照組和空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，磷酸化AKT，AKT，MEK，ERK表達在三組之間無顯著性差異。