應(yīng)用RhoA shRNA對原發(fā)性肝癌生物學(xué)行為的調(diào)控研究.pdf

1、研究背景與目的:原發(fā)性肝癌(PHC)是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，其死亡率位居各類惡性腫瘤的第二位。造成PHC高死亡率的主要原因是其惡性增殖的特性和易于發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。癌細胞的增殖和凋亡失衡是其核心環(huán)節(jié)，侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌細胞的本質(zhì)特征。肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移首先來源于癌細胞個體的移行，涉及到癌細胞的變形、粘附、細胞外基質(zhì)降解、多基因激活、轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)等復(fù)雜的細胞生物學(xué)過程。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細胞的移行過程與細胞骨架的變化密切相關(guān)。近年來人們發(fā)

2、現(xiàn)一類新的細胞因子Rho在調(diào)控細胞骨架變化過程中發(fā)揮著重要的作用，RhoA因子是Rho家族中的標(biāo)志性因子，它在人類的很多惡性腫瘤中異常表達，提示其在腫瘤形成中發(fā)揮著重要的作用。本課題擬從肝癌生物學(xué)特性出發(fā)，探討RhoA在組織和細胞水平對PHC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，為進一步研究其生物學(xué)行為的內(nèi)在分子機制提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:收集同濟醫(yī)院外科30例PHC手術(shù)切除標(biāo)本，用RT—PCR和western—Blot的方法檢測癌組織

3、、癌旁組織中RhoA基因mRNA和蛋白表達的相對水平，并通過與病例臨床病理特征(性別、腫瘤直徑、細胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無淋巴結(jié)靜脈浸潤以及有無肝外轉(zhuǎn)移灶)的分析，以探討RhoA基因在PHC組織增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。在體外水平，首先用RT-PCR和Western-Blot方法比較RhoA基因在各肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、HepG2.2.15和Hep3B)及正常胚胎肝細胞系LO2中的表達；然后用Pgenesil-2質(zhì)

4、粒構(gòu)建RhoAshRNA的真核表達載體和對所有哺乳類基因組無任何干擾效應(yīng)對照shRNA的真核表達載體；脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染至高表達RhoA的人肝癌細胞系HepG2qh；通過篩選得到具有干擾效應(yīng)的序列載體，將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到HepG2中，用選擇性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定低表達RhoA基因的HepG2細胞株及正常表達RhoA基因的對照HepG2細胞株，侵襲小室(transwell)檢測這些細胞株的侵襲和遷移能力；并用染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酉h

5、(CFSE)標(biāo)記這些細胞株后，流式細胞儀檢測細胞的增殖情況。
　　 結(jié)果:
　　 l、PHC癌組織和癌旁組織中均可檢測至ORhoA基因mRNA和蛋白的表達。RhoA基因mRNA和蛋白水平在PHC癌組織中的表達均較癌旁組織高，其吸光度(A)比值分別為1.45±0.66和1.18±0.53；35.74±2.38和16.50±1.53，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、分別以細胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、

6、有無淋巴結(jié)靜脈浸潤以及有無肝外轉(zhuǎn)移灶這些因素對PHC癌組織進行分組比較，RhoA mRNA和蛋白的表達量均具有顯著的差異(P<0.05)，說明RhoA的表達量與PHC的細胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無淋巴結(jié)靜脈浸潤以及有無肝外轉(zhuǎn)移灶有關(guān)；而以性別和腫瘤直徑分組，RhoA mRNA和蛋白的表達量無顯著差異(P>0.05)，說明RhoA的表達量與性別和腫瘤直徑關(guān)聯(lián)性不大。
　　 3、在各肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、HepG

7、2.2.15和HHep3B)中，RhoA mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于正常人肝胚胎細胞系LO2(P<0.05)。
　　 4、成功構(gòu)建了RhoAshRNA質(zhì)粒表達載體(pshRNA—RhoAl及pshRNA—RhoA2)及對照載體(pshRNA—HK)，并在轉(zhuǎn)染HepG2后，篩選出能夠特異性抑制JRhoA基因表達的shRNA質(zhì)粒表達載體(pshRNA—RhoA2)。
　　 5、成功建立了穩(wěn)定低表達RhoA的HepG2

8、細胞株(pshRNARhoA—HepG2)及對照HepG2細胞株(pshRNAHK—HepG2)。
　　 6、在侵襲和遷移能力實驗中，各組穿膜細胞個數(shù)分別為：pshRNARhoA—HepG2組(34.1±3.2/25.2±2.1)、pshRNAHK—HepG2組(62.0±2.8/39.5±1.6)和空白細胞HepG2組(65.3±3.4/41.7±2.9)?？梢娕cHepG28目比，pshRNARhoA—HepG2侵襲和遷移能力

9、均明顯下降(P<0.05)，而pshRNAHK—HepG2去H未有明顯變化(P>0.05)，提示HepG2細胞中RhoA的表達降低后，侵襲和遷移能力均顯著降低。
　　 7、RhoAshRNA對肝癌細胞增殖能力的影響：pshRNARhoA—HepG2、pshRNAHK—HepG2和空白細胞HepG2分別用CFSE標(biāo)記后，流式檢測的結(jié)果顯示，pshRNARhoA—HepG2的增殖系數(shù)為40.33，而pshRNAHK—HepG2的增殖

10、系數(shù)為61.26，HepG2的增殖系數(shù)為66.15?？梢娕cHepG2相比，pshRNARhoA—HepG2的增殖速度明顯減慢(P<0.05)，而pshRNAHK—HepG2的增殖速度卻沒有明顯變化(P>0.05)。說明HepG2細胞中RhoA的表達降低后，增殖能力明顯降低。
　　 結(jié)論:RhoA基因在原發(fā)性肝癌組織中和體外肝癌細胞系中均過量表達，并與反映肝癌浸潤和轉(zhuǎn)移性的臨床病理特征密切相關(guān)，抑制肝癌細胞系中RhoA基因的表達后