上皮間質轉化在調控肝癌惡性生物學行為中的作用及其機制研究.pdf

1、肝細胞癌(HCC)是我國常見的癌癥，位居癌癥死亡率第三位。肝癌發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多途徑、多階段的復雜過程，傳統(tǒng)治療方法療效有限。只有深入了解肝癌生物學分子作用機制并從中尋找肝癌靶向治療的有效靶點，才能從根本上達到徹底根治肝癌的目的。
　　侵襲、轉移性是惡性腫瘤的重要生物學行為特征。大部分肝癌患者因腫瘤轉移而喪失了手術的機會，而即使接受手術治療，術后發(fā)生腫瘤轉移及復發(fā)的幾率也非常高。因此，侵襲、轉移是影響肝癌患者的預后重要因素之

2、一。次外，化療，包括經(jīng)導管動脈栓塞化療（transcatheterarterialchemoembolization，TACE）及靶向藥物的治療，是目前肝癌綜合治療的重要手段，也是提高肝癌患者預后的重要途徑之一。然而原發(fā)性或繼發(fā)性化療耐藥的產(chǎn)生已成為制約肝癌化療療效的主要瓶頸，且化療多為非根治性治療，肝癌化療后的殘存細胞可能發(fā)生一些嚴重的生物學行為改變，甚至有學者認為肝癌化療后的殘留腫瘤細胞，其轉移能力、惡性程度均明顯升高，從而嚴重影響

3、肝癌的治療療效。因此探索肝癌侵犯、轉移及化療耐藥產(chǎn)生的機制并加以有效的干預是肝癌防治中迫在眉睫的事情。
　　上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮細胞在正常生理和特定病理情況下向間充質細胞轉化的現(xiàn)象，已有的理論表明EMT在調控腫瘤的惡性生物學行為中可能發(fā)揮了重要的作用。而Snail、Twist、FOXC1、ZEB1等是調控EMT過程的關鍵轉錄因子。為此，本課題組以篩選EM

4、T相關轉錄因子的差異表達及其功能研究為切入點，深入探討了EMT與肝癌侵襲轉移、化療耐藥的關系。在第一部分內(nèi)容中，我們首先進行臨床資料的篩選，提示FOXC1可能是促進肝癌轉移的重要原因，并從體外實驗進一步驗證了FOXC1在誘導肝癌發(fā)生EMT及增強侵襲轉移能力中的作用;在第二部分研究中，我們首先用DDP間斷化療+缺氧的方法來處理肝癌細胞，模擬TACE過程、建立體外細胞模型，我們觀察到這些細胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象，并同時獲得了一些腫瘤干細胞樣特征

5、。其次，我們篩選了DDP+缺氧誘導后的殘余細胞中EMT相關轉錄因子的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)ZEB1表達異常升高，提示ZEB1在肝癌耐藥、耐缺氧形成中可能發(fā)揮了重要作用，為此我們進一步研究了ZEB1表達對肝癌細胞耐藥、耐缺氧性的影響。最后我們通過研究ZEB1對miR-200c的直接調控作用進一步明確了ZEB1的作用機制。本課題組嘗試從EMT相關轉錄因子的水平來探討EMT在調控肝癌侵襲轉移、化療耐藥等惡性生物學行為中的作用及可能的機制，探討并豐

6、富了肝癌細胞侵襲轉移、化療耐藥產(chǎn)生的理論，為下一步肝癌治療領域基因藥物的開發(fā)提供可靠的實驗依據(jù)。
　　第一部分FOXC1通過調控上皮間質轉化促進肝癌侵襲轉移性的研究
　　目的:
　　脈管癌栓是肝癌發(fā)生侵襲、轉移的早期指標之一，其形成機制尚不明確，上皮間質轉換（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是腫瘤發(fā)生、轉移過程中的重要分子事件，本項目擬通過研究EMT在肝癌血管癌栓形成中的作用來

7、進一步明確EMT對肝癌侵襲、轉移能力的影響。
　　方法:
　　選擇無脈管癌栓及合并脈管癌栓的肝癌組織標本各15例，realtimeRT-PCR方法篩選出差異表達最明顯的EMT關鍵轉錄因子FOXC1;在組織標本及8種肝癌細胞系中用realtimeRT-PCR、Western-blot方法檢測FOXC1的表達并分析其臨床意義;選擇FOXC1高表達的兩種肝癌細胞株Bel-7402及SK-Hep1，用shRNA轉染的方法敲除FOXC

8、1的表達后，檢測上皮及間質表型標記物及snail，slug，twist等轉錄因子的表達變化;比較FOXC1敲除前后細胞生長速度的差異，并檢測細胞凋亡及周期的變化;比較FOXC1敲除前后細胞侵襲、轉移能力的變化，并檢測了細胞骨架、部分MMPs家族蛋白及VEGF-A的差異表達;選擇FOXC1低表達的細胞系Huh7，通過轉染的方法過表達snail和twist，或用TGF-β細胞因子處理后檢測其FOXC1的表達變化。
　　結果:
　

9、　與無脈管癌栓的組織相比，合并脈管癌栓的肝癌標本中FOXC1表達明顯升高(P＜0.05);54％(27/50)配對標本的肝癌組織中FOXC1的表達水平高于癌旁組織，但癌及癌旁組織之間的FOXC1表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，臨床病理資料分析進一步發(fā)現(xiàn)肝癌組織中FOXC1的表達水平與腫瘤的分化程度、脈管癌栓形成相關(P＜0.05);在Bel-7402及SK-Hep1細胞中敲除FOXC1后，間質表型標記物如vimentin、N-ca

10、dherin表達降低，但上皮表型標記物只有部分升高（ZO-1、Claudin-1表達升高，而E-cadherin表達無明顯變化）;敲除FOXC1后細胞生長受抑制，流式細胞儀提示細胞發(fā)生G0/1期阻止;敲除FOXC1使MMP1、MMP2、MMP7、MMP9及VEGF-A表達明顯降低;敲除FOXC1表達后snail，slug，twist表達無明顯差異，而過表達snail和twist，或用TGF-β處理后，F(xiàn)OXC1表達水平明顯升高。

11、　　結論:
　　在合并脈管癌栓的肝癌組織中FOXC1的表達明顯升高;抑制FOXC1的表達能部分逆轉EMT過程，主要表現(xiàn)為間質表型標記物升高，而上皮表型標記物只有部分降低;敲除FOXC1基因的表達還能降低腫瘤細胞生長速度、下調MMPs、改變細胞骨架、調控VEGF-A的表達，進而發(fā)揮抑制腫瘤生長、降低腫瘤侵襲轉移能力等功能。
　　第二部分上皮間質轉化誘導肝癌細胞化療耐藥性的機制研究
　　目的:
　　經(jīng)導管動脈栓塞化療

12、（transcatheterarterialchemoembolization、TACE）是治療中晚期肝癌的主要手段之一，然而TACE在改善患者的長期生存中的作用仍存在較大的爭議，甚至有學者認為TACE可能增加部分患者的遠處轉移幾率。TACE是非根治性的治療手段，經(jīng)TACE治療后的殘余肝癌細胞發(fā)生耐藥、耐缺氧及其它生物學改變可能是影響TACE療效的瓶頸，因此深入研究化療+缺氧誘導后殘余肝癌細胞的生物行為特征具有十分重要的意義。上皮間質轉

13、化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是目前化療耐藥等惡性腫瘤生物學行為研究中的一個熱點。關于EMT與肝癌化療耐藥、耐缺氧的關系目前還沒有明確的研究。
　　方法:
　　本實驗采用間斷順鉑(DDP)+缺氧培養(yǎng)的方法對肝癌細胞BEL-7402及MHCC-LM3進行體外誘導、篩選，根據(jù)其母細胞來源將經(jīng)上述處理后的細胞分別命名為DDP、缺氧誘導的殘余細胞(DDP-，hypoxia-induce

14、dresiduecells，DHR)7402/DHR及LM3/DHR細胞;通過形態(tài)學觀察及上皮、間質表型標記物檢測判斷化療+缺氧能否誘導發(fā)生EMT;通過克隆形成、裸鼠體內(nèi)成瘤試驗及檢測腫瘤干細胞表面標記物的表達水平判斷7402/DHR及LM3/DHR是否具有腫瘤干細胞特性;通過基因敲除的方法研究ZEB1表達對肝癌細胞耐藥性的影響;同時，通過病毒轉染并建立穩(wěn)轉細胞系，利用realtimeRT-PCR等方法研究ZEB1對miR-200c表達

15、的調控作用并通過熒光素酶報告實驗來進一步確認;通過western-blot、雙熒光素酶報告實驗來研究miR-200c對靶基因Bmi-1的直接調控作用。
　　結果:
　　7402/DHR及LM3/DHR形態(tài)學上發(fā)生了明顯變化，包括細胞極性消失，呈梭形或紡錘形;7402/DHR及LM3/DHR表現(xiàn)出一些干細胞特性，包括克隆形成能力增強、裸鼠體內(nèi)成瘤率增加、腫瘤干細胞相關表面標記物如CD133及CD326表達升高等;EMT相關標記

16、物的檢測提示7402/DHR及LM3/DHR發(fā)生了EMT，包括上皮表型標記物E-cadherin表達下調，間質表型標記物N-cadherin、Vimentin表達升高等;通過檢測調控EMT的關鍵轉錄因子，我們發(fā)現(xiàn)7402/DHR及LM3/DHR細胞中ZEB1的表達明顯水平升高，而敲除ZEB1表達能部分逆轉7402/DHR細胞的化療耐藥性，提示ZEB1在肝癌化療耐藥形成中的作用，但敲除ZEB1表達對細胞耐缺氧能力無顯著影響。7402/DH

17、R及LM3/DHR細胞中miR-200c及miR-203的表達均明顯降低，而轉染miR-200c的類似物（mimics）能部分逆轉7402/DHR的化療耐藥;RealtimeRT-PCR檢測提示ZEB1高表達能降低miR-200c的表達水平，而熒光素酶報告實驗結果也提示ZEB1能直接抑制miR-200c的啟動子活性，提示ZEB1能直接抑制miR-200c的表達;Western-blot及熒光素酶雙報告實驗提示Bmi-1基因是miR-20