癌基因RMP在肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、目的：通過研究RMP過表達(dá)和RMP干擾表達(dá)的HepG2細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)、粘附能力和遷移侵襲能力的改變,探究RMP對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的影響。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)室保存的RMP過表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.1-RMP和 RMP干擾質(zhì)粒pGPU6-RMPi經(jīng)雙酶切鑒定無誤后進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染;確定肝癌HepG2細(xì)胞的G418藥物篩選濃度;轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒后的HepG2細(xì)胞經(jīng)G418篩選得到RMP過表達(dá)細(xì)胞株和RMP干擾表達(dá)細(xì)胞株;各細(xì)胞株分別通過RT-

2、PCR,qRT-PCR,CCK-8實(shí)驗(yàn)鑒定所得細(xì)胞株中外源質(zhì)粒的整合情況,檢測(cè)RMP mRNA的表達(dá)水平和細(xì)胞增殖水平;倒置顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài);粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RMP對(duì)肝癌細(xì)胞異質(zhì)粘附能力的影響;劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RMP過表達(dá)和干擾表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變;Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)探討瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同劑量pCDNA3.1-RMP質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響;RT-PCR和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

3、分別檢測(cè)各組細(xì)胞的MMPs表達(dá)量和酶活性;Western Blot檢測(cè)各細(xì)胞株中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等EMT相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定,成功檢測(cè)到 RMP過表達(dá)質(zhì)粒:pCDNA3.1-RMP中1619bp的重組RMP條帶;RMP干擾質(zhì)粒:pGPU6-RMPi中53bp的發(fā)卡條帶。⑵HepG2細(xì)胞于含不同濃度G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后,得出600ng/μl為最佳

4、G418藥物篩選濃度。⑶HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒24h后,加入G418篩選14天,經(jīng)單克隆挑取和單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并鑒定,得到目標(biāo)細(xì)胞株。⑷倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)RMP過表達(dá)的HepG2細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N型,細(xì)胞與細(xì)胞間粘附消失。⑸軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證明,RMP過表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的錨定非依賴生長(zhǎng)能力(p<0.01),干擾RMP表達(dá)后肝癌細(xì)胞錨定非依賴生長(zhǎng)能力降低(p<0.05)。進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),RMP過表達(dá)的HepG2細(xì)

5、胞株形成的腫瘤微球形態(tài)松散,喪失細(xì)胞間粘附。而干擾 RMP表達(dá)的HepG2細(xì)胞株所形成的腫瘤微球形態(tài)緊實(shí),胞間粘附完整。⑹粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,RMP過表達(dá)能夠降低肝癌細(xì)胞的異質(zhì)粘附能力(p<0.001),干擾RMP表達(dá)則不影響肝癌細(xì)胞的粘附能力。⑺劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證明了RMP過表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力(p<0.001),并且隨 RMP表達(dá)量的升高,細(xì)胞侵襲遷移能力也顯著升高(p<0.001)。⑻RT-PCR檢

6、測(cè)發(fā)現(xiàn)RMP過表達(dá)能夠提高肝癌細(xì)胞中MMP-2,MMP-9的表達(dá)水平(p<0.001),干擾RMP則降低細(xì)胞中MMP-2,MMP-9的表達(dá)水平(p<0.001)。⑼明膠酶譜實(shí)驗(yàn)則證明了RMP對(duì)細(xì)胞活性MMP-2的分泌是至關(guān)重要的(p<0.001)。⑽Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RMP在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)能夠抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)(p<0.001),并促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)

7、(p<0.001),干擾RMP表達(dá)則不影響上述三種蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)論：①RMP可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外遷移,并且能夠通過促進(jìn)MMPs的表達(dá),增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。干擾RMP表達(dá)則能夠抑制這一現(xiàn)象。②RMP能夠影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和3D培養(yǎng)中的集落形態(tài),并上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin,Vimentin,抑制上皮粘附分子E-cadherin,說明RMP過表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,但干擾肝癌細(xì)胞中的RMP的表達(dá)