腫瘤微環(huán)境不同成分在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的癌癥之一，在男性常見癌癥中排名第五，女性常見癌癥中排名第七，死亡率在癌癥中排名第三。全世界每年有超過70萬的新發(fā)肝癌病例，其中50％以上在中國，約36萬人，因此我國是一個肝癌大國。肝癌發(fā)生的主要危險因素有HBV感染、HCV感染、酗酒和黃曲霉素攝入等。目前，肝癌手術(shù)切除仍然是治療肝癌的最有效方法。隨著手術(shù)方式不斷改進，肝癌手術(shù)切除率大為提高，術(shù)后5年生存率也

2、提高到50％～60％。然而，與其他消化道惡性腫瘤相比，HCC的外科治療效果尚不能令人滿意。術(shù)后腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者不能長期生存的主要原因。肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移又是一個十分復雜的過程，因此只有深入了解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制并尋找有效的治療靶點，才能從根本上達到根治肝癌的目的。
　　 隨著對腫瘤認識的不斷深入，人們意識到腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌，

3、改變和維持自身生存和發(fā)展的條件，促進腫瘤的生長和發(fā)展。全身和局部組織亦可通過代謝、分泌、免疫、結(jié)構(gòu)和功能的改變，限制和影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。提示不同成分的TME對腫瘤的作用具有異質(zhì)性。TME是由腫瘤細胞、腫瘤所在組織細胞、基質(zhì)細胞、細胞因子、趨化因子等組成。其中基質(zhì)細胞包括成纖維細胞、免疫細胞、骨髓來源未成熟細胞(Bone marrow derived immature cell，BMDC)等。近年的研究發(fā)現(xiàn):TME中的腫瘤相關(guān)成纖維細

4、胞(Tumor-associated fibroblast，TAF)可以通過誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)從而促進腫瘤的進展;TME中的細胞因子和趨化因子也可以通過多種途徑來調(diào)節(jié)腫瘤的進展。然而，腫瘤所在組織的正常上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用研究罕見報道。在本課題中的第一部分，我們運用不同的細胞培養(yǎng)模型:雙層六孔板共培養(yǎng)肝癌細胞和肝臟永生化正常上皮

5、細胞，雙層六孔板共培養(yǎng)肝癌細胞和血管內(nèi)皮細胞，人胚肺成纖維細胞(MRC-5)的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細胞，嘗試著揭示TME的不同成分在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用并探索相關(guān)機制。在第一部分的基礎(chǔ)上，我們進一步闡明了人胚肺成纖維細胞(MRC-5)影響肝癌細胞侵襲及遷移，增殖和凋亡等生物學行為的分子機制。進一步認識了肝癌術(shù)后復發(fā)及轉(zhuǎn)移的機理，為下一步的以TME為靶點的分子治療提供了新的思路。
　　 第一部分類似上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT-like p

6、recession)及間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-epithelial transition，MET)體外誘導過程
　　 目的:
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前認為，不同成分的TME能分別誘導EMT及MET。本實驗通過共培養(yǎng)肝癌細胞與肝臟永生化正常上皮細胞，共培養(yǎng)肝癌細胞與血管內(nèi)皮細胞，MRC-5條件培養(yǎng)基(Conditioned medium，CM)培養(yǎng)肝癌

7、細胞，模擬TME與腫瘤細胞的相互作用，探索能否在體外誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT及MET，并嘗試闡述相關(guān)的分子機制。
　　 方法:
　　 共培養(yǎng)模型:雙層六孔板共培養(yǎng)肝癌細胞與肝臟永生化正常上皮細胞，雙層六孔板共培養(yǎng)肝癌細胞與血管內(nèi)皮細胞。CM培養(yǎng)模型:分別用MRC-5，肝臟永生化正常上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞的CM培養(yǎng)肝癌細胞。培養(yǎng)一定時間后，通過transwell方法檢測肝癌細胞侵襲及遷移能力是否發(fā)生改變，并用蛋白質(zhì)印跡法(W

8、estem blot)檢測上皮標志物(Epithelial marker)，間質(zhì)標志物(Mesenchymalmarker)，EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(EMT-related transcription factors，EMT-related TFs)及基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteases，MMPs)在蛋白水平的表達情況。之后通過激光共聚焦(Confocal laser scanning microscope，CL

9、SM)檢測E-鈣粘素/β-連環(huán)蛋白復合體(E-cadherin/β-catenin complex)，α-連環(huán)蛋白(α-catenin)，γ-連環(huán)蛋白(γ-catenin)在肝癌細胞膜上的表達情況，檢測波形蛋白(Vimentin)，N-鈣粘素(N-cadherin)，Snail蛋白，Slug蛋白及Twist1蛋白在肝癌細胞中的表達量，并確定肌動蛋白(Actin)的存在形式。應用RT-PCR檢測層粘連蛋白(Laminin)及整合素(Int

10、egrin)在與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)90天后的肝癌細胞，MRC-5-CM，肝臟永生化正常上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞的CM培養(yǎng)28天后的肝癌細胞及miR-200a mimics轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞中mRNA水平的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 肝癌細胞與肝臟永生化正常上皮細胞及與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)44天后其侵襲及遷移能力較對照組顯著降低(P＜0.05);α-catenin，β-catenin和E-cadherin蛋白在細胞膜上的表達

11、較對照組增高，說明E-cadherin/catenin complex保持得更完整;另外，纖維狀肌動蛋白(Fibros actin，F(xiàn)-actin)表達較對照組減少。MRC-5-CM培養(yǎng)肝癌細胞14天后，細胞形態(tài)伸展，變得細長，F(xiàn)-actin增多，侵襲及遷移能力較對照組顯著增強(P＜0.05)。肝臟永生化正常上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞的CM培養(yǎng)14天后的肝癌細胞的生物學行為沒有發(fā)生明顯的改變。RT-PCR結(jié)果顯示:lamininA1，A2及

12、integrinA4，A11，AL，AM，AV，B6，B7，B8在MRC-5-CM培養(yǎng)28天后的肝癌細胞中的表達較對照組顯著增高，integrinB4顯著降低。相反，lamininA1，A2及 integrinA4，A11，AL，AM，AV，B6，B7，B8在與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)90天后的及miR-200a mimics轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞中的表達較對照組顯著降低，integrinB4卻顯著增高。
　　 結(jié)論:
　　 肝臟永

13、生化正常上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞能誘導肝癌細胞發(fā)生MET，MRC-5能誘導肝癌細胞發(fā)生EMT-like precession。TME誘導肝癌細胞發(fā)生EMT/MET通過調(diào)節(jié)E-cadherin/catenin complex，laminins，integrins蛋白的表達。
　　 第二部分人胚肺成纖維細胞MRC-5的條件培養(yǎng)基通過多條途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞的侵襲，遷移，增殖和凋亡
　　 目的:
　　 MRC-5的條件培養(yǎng)基

14、(CM)能促進乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，但其對肝癌細胞的作用尚未被很好的研究。在本課題中我們應用了一系列的細胞生物學實驗來驗證MRC-5-CM在肝癌細胞侵襲，遷移及生長中的作用，并嘗試闡述其分子機制。
　　 方法:
　　 MRC-5-CM培養(yǎng)肝癌細胞21天，采用流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)C)檢測肝癌細胞活力的改變，采用transwell檢測其侵襲及遷移能力的改變。最后應用Westernblot和免疫熒光技

15、術(shù)(Immunofluorescence，IF)等實驗方法對MRC-5-CM在肝癌細胞中的作用機制作出探討。
　　 結(jié)果:
　　 FC檢測結(jié)果提示MRC-5-CM誘導肝癌細胞株Bel-7402發(fā)生了G1期阻滯(P=0.002)，S期細胞百分率較對照組顯著降低(P=0.001);然而，MRC-5-CM誘導肝癌細胞株MHCC-LM3發(fā)生了S期阻滯，S期細胞百分率較對照組明顯增高(P=0.017)，G2/M期細胞百分率顯著降低

16、(P=0.011)。同時，我們還發(fā)現(xiàn)MRC-5-CM明顯抑制了Bel-7402的凋亡(P=0.000)，然而，MRC-5-CM明顯誘導了MHCC-LM3的凋亡(P=0.002)。通過Western blot檢測細胞周期蛋白(Cyclin)，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKI)，P53，視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制蛋白(Retinoblastoma tumor suppressor protein，RB)，磷酸化

17、的視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制蛋白(phosphorylated RB，pRB)，抗凋亡Bcl-2蛋白家族成員(Pro-survival Bcl-2family proteins)和促凋亡Bcl-2蛋白家族成員(Pro-apoptosis Bcl-2 family proteins)，結(jié)果提示MRC-5-CM通過多條途徑影響肝癌細胞的活力，包括通過調(diào)節(jié)上述經(jīng)典的周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達。Transwell結(jié)果提示MRC-5-CM能明顯促進肝癌細胞

18、的侵襲及遷移(P＜0.05)。Westemblot檢測結(jié)果提示MRC-5-CM促進肝癌細胞的侵襲及遷移不是通過上調(diào)EMT-related TFs(Snail/Twist1/ZEB-1/ZEB2)進而誘導肝癌細胞發(fā)生經(jīng)典的EMT; MRC-5-CM能上調(diào)α6，β3，β4，β7-integrin蛋白，并激活下游的FAK/Src信號通路(integrin/FAK/Src signaling pathway); MRC-5-CM能上調(diào)激活的MM

19、P-2。IF結(jié)果提示MRC-5-CM能顯著破壞肝癌細胞膜上的E-cadherin/catenin complex進而誘導非經(jīng)典的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Non-classical EMT)。
　　 結(jié)論:
　　 MRC-5-CM通過誘導肝癌細胞發(fā)生非經(jīng)典的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Non-classicalEMT)，激活integrin/FAK/Src signaling pathway和上調(diào)激活的MMP-2等三個方面促進肝癌細胞的侵襲及遷移