肝癌微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率居所有惡性腫瘤死亡率的第二位。腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment，TME)是指腫瘤發(fā)生發(fā)展的局部病理環(huán)境。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不僅由惡性腫瘤細(xì)胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞成分密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為癌癥基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage，TAM)

2、是腫瘤微環(huán)境中眾多炎癥細(xì)胞的主要成員，約占炎癥細(xì)胞總數(shù)的30％-50％。本研究中，我們?cè)隗w外誘導(dǎo)培養(yǎng)M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用BioLevitatorTM三維細(xì)胞培養(yǎng)儀，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的立體共培養(yǎng)體系;運(yùn)用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜;基于生物信息學(xué)分析技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選其中的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)

3、分子，明確其對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響，并進(jìn)一步采用RT-PCR和Westernblot等技術(shù)深入探討其促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本研究旨在從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度闡明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為今后肝癌轉(zhuǎn)移的靶向治療提供新思路。
　　第一部分 M1和M2兩種極化的巨噬細(xì)胞模型的體外誘導(dǎo)與鑒定
　　巨噬細(xì)胞由血液中的單核細(xì)胞分化而來(lái)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體特異性免疫防御和非特異性免疫防御中均發(fā)揮重要作用。

4、巨噬細(xì)胞是一類動(dòng)態(tài)變化的免疫細(xì)胞群，表型的異質(zhì)性和功能的多樣性是其主要的特征。巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境能夠發(fā)生不同性質(zhì)的活化，分化成為具有不同表型標(biāo)志物和功能特征的細(xì)胞亞群。研究表明，巨噬細(xì)胞的極化主要包括兩種類型:一種是經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classic activation ofmacrophage，M1)，另一種是替代激活的巨噬細(xì)胞(alternative activationof macrophage，M2)。本部分旨在體外建立M

5、1和M2兩種極化的巨噬細(xì)胞模型，為后繼的研究奠定基礎(chǔ)。我們?cè)谑褂梅鸩?PMA)將人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1體外誘導(dǎo)分化成為未分化的巨噬細(xì)胞(unactivatedmacrophage，UaM)的基礎(chǔ)上，選用脂多糖(LPS)和IFN-γ為M1型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，選用IL-4和IL-13為M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，使用倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)變化，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)M1和M2兩種巨噬細(xì)胞表面分子CD68、CD206和

6、CD163的表達(dá)水平，用ELISA檢測(cè)M1和M2兩種巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10和IL-12的分泌水平，用熒光定量PCR檢測(cè)M1和M2兩種巨噬細(xì)胞不同表型分子標(biāo)志物TNF-α、CCL3、iNOS、Arg-1、AMAC-1和CCL22 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞呈不規(guī)則形或者長(zhǎng)梭形，高表達(dá)IL-12、TNF-α、CCL3和iNOS; M2型巨噬細(xì)胞多呈圓形或類圓形，抱團(tuán)生長(zhǎng)，高表達(dá)IL-10、CD206、CD163

7、、Arg-1、AMAC-1和CCL22，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，表明我們成功建立了M1和M2兩種極化的巨噬細(xì)胞模型。
　　第二部分 M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在肝癌細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymaltransition，EMT)是上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟，已成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究的焦點(diǎn)。肝癌是一種典型的上皮源性腫瘤，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和缺乏有效的治療手段是導(dǎo)致其高死亡率的主要原

8、因，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已經(jīng)成為提高肝癌治療效果與生存率的最大障礙。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不僅由惡性腫瘤細(xì)胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。本部分主要研究M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和粘附能力以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。我們?cè)隗w外將人單核白血病細(xì)胞THP-1誘導(dǎo)分化成為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用transwell小室建

9、立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞Huh7和SMMC7721的共培養(yǎng)體系，利用侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細(xì)胞侵襲、遷移和粘附能力的變化，用熒光定量PCR檢測(cè)共培養(yǎng)前后Huh7和SMMC7721細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin, N-cadherin, Vimentin和α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)4

10、8 h后，肝癌細(xì)胞Huh7和SMMC7721形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，由原來(lái)上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成為一種梭形的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)，而粘附能力下降。熒光定量PCR顯示，共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)水平下降，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin，Vimentin和α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平上升，表明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲。
　

11、　第三部分 M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的三維立體共培養(yǎng)體系的建立及關(guān)鍵差異蛋白的篩選與驗(yàn)證
　　分泌蛋白質(zhì)組(secretome)是指在一定的時(shí)間和空間條件下，組織和細(xì)胞等分泌的全部蛋白質(zhì)。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)(Secretomics)是指利用蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)對(duì)分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行廣泛和深入的研究。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞相互作用，相互影響，共同決定了腫瘤細(xì)胞的歸宿。在腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞相互作用的過(guò)程中，腫

12、瘤微環(huán)境中的分泌蛋白質(zhì)充當(dāng)了“橋梁”的作用，其功能網(wǎng)絡(luò)是維持腫瘤與間質(zhì)穩(wěn)態(tài)，決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要媒介。本部分中，我們應(yīng)用BioLevitatorTM三維細(xì)胞培養(yǎng)儀，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的立體共培養(yǎng)體系;運(yùn)用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜;采用生物信息學(xué)分析技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選其中的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子，并使用W

13、estern blot對(duì)部分關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，為進(jìn)一步深入探討腫瘤微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的相互作用，闡明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第四部分 巨噬細(xì)胞源性IL-1β對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能的影響及其分子機(jī)制研究
　　肝癌是一種經(jīng)典的炎癥伴隨腫瘤，病因以慢性肝炎病毒感染為主，具有慢性炎癥改變和免疫調(diào)節(jié)紊亂兩大病變基礎(chǔ)。隨著慢性炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到進(jìn)一步解析

14、，炎癥與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。白細(xì)胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)是體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的核心介質(zhì)，主要由炎癥狀態(tài)下或免疫反應(yīng)中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，其對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本部分中，我們使用外源性重組人IL-1β誘導(dǎo)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞SMMC7721，采用侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-1β對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721侵襲能力、遷移能力和粘附能力的影響，用熒光定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)

15、志物mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，用Western blot檢測(cè)IL-1β誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)SMMC7721細(xì)胞NF-κ B通路信號(hào)分子NF-κB（p65，胞核）、IκBα（胞漿）和P-IκBα（胞漿）以及EMT相關(guān)標(biāo)志物Snail的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)48 h后，SMMC7721細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣梭形改變;細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)，粘附能力下降;細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)水平下降

16、，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2mRNA表達(dá)水平上升;Western blot結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)后NF-κB(p65，胞核)、P-IκBα（胞漿）和Snail蛋白表達(dá)上調(diào)，IκBα（胞漿）蛋白表達(dá)下調(diào)，并且具有明顯的時(shí)間依賴性。另外，NF-κB通路特異性抑制劑BAY11-7082處理能夠減弱甚至逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721轉(zhuǎn)移潛能及EMT的促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明

17、，IL-1β通過(guò)NF-κB/Snail途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，阻斷NF-κ B通路能夠顯著降低IL-1β對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的促進(jìn)作用，IL-1β可能是肝癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。
　　1.體外成功誘導(dǎo)并建立了M1和M2兩種極化的巨噬細(xì)胞模型。
　　2.M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能。
　　3.成功應(yīng)用BioLevitatorTM三維細(xì)胞培養(yǎng)儀

18、模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立了M2、SMMC7721以及M2+SMMC7721的三種立體培養(yǎng)體系，并運(yùn)用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立了三種立體培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜，其中IL-1β是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)相互誘導(dǎo)產(chǎn)生的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　4.IL-1β主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)NF-κB/Snail信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，最終發(fā)揮其促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移