M2型巨噬細(xì)胞對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)，是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)多器官功能障礙綜合征(MODS)中肺部的首要表現(xiàn)，常由創(chuàng)傷、燒傷、感染、休克等多種因素所誘發(fā)，病情嚴(yán)重且進(jìn)展迅速。近年來(lái)，眾多學(xué)者圍繞ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制和防治策略進(jìn)行了廣泛的研究，但仍缺乏快速高效的治療方案，發(fā)病率和死亡率仍居高不下。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞之一，其在機(jī)體的免疫監(jiān)視、免疫引發(fā)和病原清除中均擔(dān)任重要角色，可以識(shí)別侵入機(jī)體的致

2、病原，并誘發(fā)免疫反應(yīng)以達(dá)到清除致病原的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的大量激活和后期凋亡均與其病理改變有著密切聯(lián)系。早期在體內(nèi)外各類病原刺激物的作用下，M1型巨噬細(xì)胞大量激活，分泌各類促炎性細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)，使中性粒細(xì)胞大量活化并遷移至炎癥部位，促進(jìn)肺部炎癥爆發(fā)且導(dǎo)致肺部組織損傷，肺血管通透性增加，產(chǎn)生肺水腫。在肺損傷的晚期，巨噬細(xì)胞更多地呈現(xiàn)為M2型，功能主要在于抑制炎癥反應(yīng)，吞噬中性粒細(xì)胞，分泌抗炎性

3、細(xì)胞因子和介質(zhì)，促進(jìn)膠原合成和傷口修復(fù)等。但若前述過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)發(fā)生失控，巨噬細(xì)胞在促炎和抑炎的過(guò)程中功能失衡。吞噬了中性粒細(xì)胞的巨噬細(xì)胞功能下降，并可發(fā)生凋亡或細(xì)胞焦亡等形式的程序性死亡，使巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，機(jī)體的抗炎功能進(jìn)一步降低，肺部炎癥和組織損傷進(jìn)一步加重。因此，明確巨噬細(xì)胞在急性肺損傷中發(fā)生發(fā)展中的作用特點(diǎn)和機(jī)制，對(duì)于探索肺損傷的治療方案有著重要的啟示和作用。
　　在本課題中，首先利用C57BL/6小鼠，培養(yǎng)并獲取骨

4、髓源性M2型巨噬細(xì)胞，隨后進(jìn)行小鼠體內(nèi)的干預(yù)治療，觀察外源性的M2型巨噬細(xì)胞補(bǔ)充對(duì)肺損傷小鼠肺部炎癥因子、細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白滲出、水腫和肺組織病理?yè)p傷的影響和規(guī)律。最后，根據(jù)變化特點(diǎn)，通過(guò)體外培養(yǎng)和抗體阻斷相結(jié)合等方法，進(jìn)一步探索其所引起變化的可能和潛在機(jī)制。
　　第一部分:骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　用骨髓細(xì)胞分化的方法培養(yǎng)出符合實(shí)驗(yàn)要求的骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞。
　　方法:
　　1.

5、選取4-5 w的健康雄性野生型C57BL/6小鼠，處死后收集下肢股骨和近端脛骨骨髓腔內(nèi)的原始骨髓細(xì)胞，給予巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF誘導(dǎo)分化7天后，更換為細(xì)胞因子IL-4分化1天，獲得骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞。
　　2.收集培養(yǎng)獲得的M2型巨噬細(xì)胞，以F4/80抗體和CD206抗體作為標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)所得的M2型巨噬細(xì)胞的純度。
　　結(jié)果:
　　給予M-CSF、IL-4誘導(dǎo)分化原始骨髓細(xì)胞，得到M2型巨噬細(xì)

6、胞。該細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，鏡下形態(tài)滿意。經(jīng)流式檢測(cè)后M2型巨噬細(xì)胞純度理想，可到90％以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　　結(jié)論:
　　骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功，后續(xù)試驗(yàn)可順利進(jìn)行。
　　第二部分:M2型巨噬細(xì)胞對(duì)急性肺損傷小鼠肺部的保護(hù)作用
　　目的:
　　探索M2型巨噬細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部炎癥反應(yīng)和病理?yè)p傷的影響。
　　方法:
　　取6-8w的C57BL/6小鼠按每組6只的方式隨機(jī)分

7、為3組:假手術(shù)(Sham)組，模型(LPS)組和細(xì)胞治療(M2)組。經(jīng)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)ALI模型后3h，M2組小鼠經(jīng)肺內(nèi)給予無(wú)菌M2型巨噬細(xì)胞懸液輸注。分別在肺損傷造模后6h、24h處死小鼠，獲得肺損傷小鼠的肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)待后續(xù)檢測(cè)。
　　1.流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BALF中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　2.BCA法檢測(cè)BALF中蛋白濃度。
　　3.ELISA法檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子TNF-α，IL-6

8、，IL-1β，IL-10的分泌。
　　4.對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行干濕比稱重計(jì)算。
　　5.將小鼠肺組織做石蠟切片進(jìn)行HE染色，然后行病理學(xué)評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　1.在術(shù)后6h和24h，M2組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞較LPS組明顯減少;在術(shù)后24h，M2組小鼠BALF中T細(xì)胞較LPS組增加(P＜0.05)。
　　2.在肺損傷后6h和24h，M2組小鼠BALF中蛋白濃度較LPS組明顯降低(P＜0.05)。
　

9、　3.在6h和24h，M2組較之LPS組，BALF中促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β水平均有明顯降低，而抑炎性細(xì)胞因子IL-10分泌增加(P＜0.05)。
　　4.在肺損傷后6h，M2組與LPS組干濕比未無(wú)差異;但在術(shù)后24h，M2組小鼠肺組織干濕比較LPS組明顯降低，證明肺水腫得到緩解(P＜0.05)。
　　5.在肺損傷后6h和24h，M2組小鼠肺部的病理?yè)p傷均較LPS組均有明顯減輕，病理評(píng)分顯著降低(P＜0

10、.05)。
　　結(jié)論:
　　骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞對(duì)急性肺損傷小鼠的肺部具有保護(hù)作用。M2型巨噬細(xì)胞可以緩解小鼠肺部病理?yè)p傷，降低富蛋白液的滲出，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌。
　　第三部分:M2型巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠肺部保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　目的:
　　探討骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠急性肺損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.將培養(yǎng)所得的M0和M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)后，

11、按照[M0/M2]細(xì)胞數(shù)[1∶10]、[1∶1]、[10∶1]的不同比例進(jìn)行混合共培養(yǎng)，給予LPS刺激24h后，收集上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-10的表達(dá)水平。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞表面PD-L1分子的表達(dá)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞治療后BALF中T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。
　　4.將小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)(Sham)組，模型(LPS)組，Isot

12、ype抗體(Isotype)組和Anti-PD-L1抗體(Anti-PD-L1)組。經(jīng)LPS造模后3h，Anti-PD-L1組予Anti-PD-L1抗體肺內(nèi)滴注后，同時(shí)予以M2型巨噬細(xì)胞輸注。在肺損傷24h處死小鼠收取BALF，檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-10的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.M0/M2共培養(yǎng)結(jié)果顯示:伴隨著M2型巨噬細(xì)胞比例的增加，促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β的分泌逐漸

13、降低;同時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加同時(shí)，抑炎性細(xì)胞因子IL-10的分泌也呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　2.M2型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1分子，其陽(yáng)性率達(dá)99％±1.8％以上。
　　3.M2型巨噬細(xì)胞治療后BALF中T細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1分子，陽(yáng)性率達(dá)95％±4.1％以上。
　　4.在阻斷PD-L1信號(hào)再輸注M2型巨噬細(xì)胞，小鼠肺部炎癥因子并未得到降低，反而有升高趨勢(shì)。阻斷PD-L1分子小鼠肺部細(xì)胞因子T