NEMO-結(jié)合肽對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠的肺保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的:急性肺損傷(ALI)及其更嚴(yán)重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床危重癥發(fā)生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高達(dá)50％。ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前為止尚未完全闡明，各種以肺為靶目標(biāo)的的傳染病、生物化學(xué)損傷、嚴(yán)重外傷與創(chuàng)傷后感染、休克、中毒均可成為ALI的主要發(fā)病因素，其病理基礎(chǔ)均表現(xiàn)為肺內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)所致的肺毛細(xì)血管膜損傷，肺水腫及透明膜形成。
　　 雖然機(jī)械通氣和全身激素治療在一定程度上延緩了A

2、LI/ARDS的進(jìn)展，但是目前臨床仍缺乏針對(duì)ALI/ARDS的有效免疫調(diào)控及肺保護(hù)手段。由于參與ALI炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷的介質(zhì)眾多，且彼此相互聯(lián)系、互為因果，在治療過(guò)程中針對(duì)單一介質(zhì)的單克隆抗體、拮抗劑、抑制劑等均未取得滿意的防治效果。此外，炎癥介質(zhì)為機(jī)體所必需，過(guò)多或不足均會(huì)造成損害，而使用抑制劑等劑量與時(shí)機(jī)很難把握，常使此類(lèi)研究陷入困境。
　　 核因子KappaB(NF-κB)信號(hào)通路是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路，在感染及創(chuàng)

3、傷等多種因素誘發(fā)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷中起重要作用。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合以無(wú)活性的三聚體形式存在于細(xì)胞漿。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、促炎介質(zhì)、病毒及細(xì)菌分解物等外界刺激后，NF-κB被激活并迅速?gòu)募?xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，在胞核內(nèi)與相應(yīng)基因上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子、誘生型一氧化氮合成酶和協(xié)同刺激分子等相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而參

4、與機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等。抑制NF-κB活化不僅可以降低炎癥損傷，還可以同時(shí)減弱氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞組織的損傷。已有研究證明抑制NF-κB活化可以明顯地降低脂多糖（LPS）所致的感染性休克小鼠死亡率。本課題組前期研究與其他國(guó)外研究均顯示抑制NF-κB過(guò)度活化可減少TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷及凋亡。因此，我們推測(cè)，NF-κB是連接ALI炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激的重要節(jié)點(diǎn)，對(duì)NF-κB的活性進(jìn)行調(diào)控是同時(shí)下調(diào)AL

5、I炎癥反應(yīng)與減輕氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵。
　　 通過(guò)抑制IκB激酶(IKK)活性進(jìn)而下調(diào)NF-κB活化程度是當(dāng)前研究ALI/ARDS干預(yù)策略的熱點(diǎn)。IKK對(duì)IκB的磷酸化是NF-κB活化的關(guān)鍵步驟，是NF-κB在炎癥反應(yīng)過(guò)程中激活的經(jīng)典途徑。IKK由IKKα、IKKB和IKKγ三個(gè)亞單位組成，其中IKKγ又稱(chēng)NEMO，是IKK的調(diào)節(jié)亞單位。研究證實(shí)IKK活化經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路依賴(lài)IKKγ的完整性。目前已經(jīng)有了針對(duì)IKK調(diào)節(jié)亞單

6、位NEMO的結(jié)合肽(NBD)，NBD可與NEMO特異性結(jié)合從而阻斷IKK復(fù)合物的組裝并下調(diào)IKK活性，進(jìn)而抑制NF-κB活化。但是如何把穩(wěn)定的具有生物學(xué)活性的NBD靶向?qū)氲椒闻K以及如何把握NBD使用劑量與給藥時(shí)機(jī)，以便更好低改善ALI失控的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，目前未見(jiàn)相關(guān)研究。
　　 在藥劑學(xué)領(lǐng)域，使用藥物載體是改善藥效，提高藥物靶向性與減少藥物不良反應(yīng)的一種措施。本研究擬利用外源性肺泡表面活性物質(zhì)(PS)包封NBD，再經(jīng)氣管

7、內(nèi)霧化的形式靶向肺部給藥，在提高藥物穩(wěn)定性的同時(shí)，能更大可能性地改善NBD對(duì)肺組織的親和力和促進(jìn)NBD進(jìn)入肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞以抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，而外源性PS則可補(bǔ)充炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激中損失的肺泡表面活性物質(zhì)，以協(xié)同達(dá)到糾正ALI病理?yè)p傷、維持正常呼吸功能的目的。
　　 綜上所述，本課題的研究目的如下:
　　 1、采用氣管內(nèi)霧化、氣管內(nèi)滴入和腹腔注射LPS復(fù)制ALI小鼠模型，評(píng)估LPS經(jīng)不同給藥方式致小鼠肺組織病理?yè)p傷

8、及炎癥反應(yīng)程度，選則手術(shù)創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)便且最接近ALI病理特點(diǎn)的小鼠模型。
　　 2、確定最佳造模方式之后，不同劑量的NBD經(jīng)氣管內(nèi)霧化預(yù)處理0.5h，評(píng)價(jià)NBD預(yù)處理對(duì)ALI小鼠肺組織過(guò)度炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　 3、選擇合適劑量的NBD充分溶解于外源性PS，探討NBD聯(lián)合PS預(yù)處理對(duì)ALI小鼠肺組織過(guò)度炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 l、LPS經(jīng)不同給藥方式致ALI小鼠模型

9、的比較研究
　　 12周齡，SPF級(jí)雄性BLAB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC group)、氣管內(nèi)霧化組（ITA group）、氣管內(nèi)滴入組(ITI group)和腹腔注射組（IPI group），每組21只。NC組小鼠腹腔注射0.1mL水合氯醛麻醉后氣管內(nèi)霧化噴入100μL空氣;ITA組小鼠麻醉后氣管內(nèi)霧化噴入LPS溶液100μL(1mg/mL);ITI組小鼠麻醉后氣管內(nèi)滴入LPS溶液100μL(1 mg/mL); IPI

10、組小鼠腹腔注射LPS溶液100μL(1mg/mL)。ITA組和ITI組各取3只小鼠用伊文斯藍(lán)溶液取代LPS溶液以顯示氣管內(nèi)霧化和滴入時(shí)藥物的肺內(nèi)分布。LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動(dòng)脈放血處死全部小鼠，充分暴露胸腔，分別取肺組織行干濕重比、HE染色及病理評(píng)分;ELISA檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-1β濃度;Real-time RT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平;Western B

11、lot檢測(cè)小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α和NF-κBp65蛋白磷酸化水平。
　　 2 、NBD預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠過(guò)度炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響
　　 12周齡，SPF級(jí)雄性BLAB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control）、模型組(model)、NBD陰性對(duì)照組(N-NBD)、NBD低劑量組(S-NBD)、NBD中劑量組(M-NBD)和NBD高劑量組(L-NBD)，每組18只。對(duì)照組小鼠腹腔注射0.1mL

12、水合氯醛麻醉后氣管內(nèi)霧化噴入100μL空氣;模型組小鼠麻醉后氣管內(nèi)霧化LPS溶液100μL(1mg/mL); NBD陰性對(duì)照組及NBD低中高劑量組小鼠麻醉后分別經(jīng)氣管內(nèi)霧化噴入相應(yīng)劑量的NBD陰性對(duì)照溶液及NBD溶液50μL，0.5h后再次經(jīng)氣管內(nèi)霧化LPS溶液50μL(2mg/mL)，LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動(dòng)脈放血處死全部小鼠。充分暴露胸腔取小鼠全肺組織行病理切片、HE染色及病理評(píng)分，ELISA檢測(cè)小鼠BALF中TNF-α和I

13、L-1β濃度;Real-time RT-PCR檢測(cè)肺組織TNF-α、IL-1β、NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;Western Blot檢測(cè)肺組織IκB-α、NOX1、NOX2、NOX4蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65蛋白磷酸化水平;比色法檢測(cè)肺組織超氧化物歧化酶活力(SOD)、總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛(MDA)濃度。
　　 3、NBD聯(lián)合PS預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠過(guò)度炎癥反應(yīng)及信號(hào)通路的

14、影響
　　 12周齡，SPF級(jí)雄性BLAB/c小鼠隨機(jī)平均分為對(duì)照組（control）、模型組(model)、PS組、PS+(N-NBD)組、PS+NBD組和NBD組，每組12只。對(duì)照組及模型組小鼠造模方法同第二章;PS和NBD組小鼠麻醉后氣管內(nèi)霧化相應(yīng)劑量的單藥PS和NBD50μL0.5h后，再次經(jīng)氣管內(nèi)霧化LPS溶液50μL(2mg/mL);PS+(N-NBD)和PS+NBD組小鼠麻醉后經(jīng)氣管內(nèi)霧化相應(yīng)劑量的PS+(N-NB

15、D)和PS+NBD混合制劑50μL0.5h后，再次經(jīng)氣管內(nèi)霧化LPS溶液50μL(2mg/mL)。LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動(dòng)脈放血處死全部小鼠，ELISA檢測(cè)小鼠BALE中TNF-α和IL-1β濃度，Real-time RT-PCR檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western Blot檢測(cè)肺組織IκB-α、NF-κB、P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)及磷酸化水平。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

16、r>　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±s）表示。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。方差齊時(shí)多重比較采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)法，顯著性水準(zhǔn)α取0.05，雙側(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1、LPS經(jīng)不同給藥方式致ALI小鼠模型的比較研究
　　 1.1氣管內(nèi)霧化伊文斯藍(lán)溶液的小鼠肺組

17、織藍(lán)染區(qū)域較分散，呈點(diǎn)狀或斑片狀分布于各肺葉。氣管內(nèi)滴入伊文斯藍(lán)溶液的小鼠肺組織藍(lán)染區(qū)域分布較集中，主要集中在主氣管兩側(cè)，呈塊狀分布，部分標(biāo)本的伊文斯藍(lán)溶液僅分布于個(gè)別肺葉，其余肺葉則未見(jiàn)藍(lán)染。
　　 1.2各組小鼠肺組織濕/干重比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組、ITI組和IPI組肺濕/干重比例均顯著高于NC組，而ITA組、ITI組和IPI組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.3各組小鼠肺組織病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA

18、組、ITI組和IPI組病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，其中ITA組和ITI組均顯著高于IPI組，而ITA組和ITI組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。ITA組小鼠各肺葉均存在彌漫性的肺泡間隔增厚與肺泡壁破壞，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與出血，血管床不同程度破壞。ITI組小鼠部分肺葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分肺葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肺葉之間病灶不均勻。IPI組小鼠在肺泡結(jié)構(gòu)、血管床破壞程度和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)方面均較輕，1.4各

19、組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組、ITI組和IPI組TNF-α和IL-1β濃度均較NC組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組和ITI組TNF-α濃度均顯著高于IPI組，而ITA組和ITI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組IL-1β濃度顯著高于ITI組和IPI組，ITI組又顯著高于IPI組。
　　 1.5各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組、ITI組和IPI

20、組TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平均較NC組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于ITI組和IPI組，而ITI組又顯著高于IPI組。ITA組IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于ITI組和IPI組，ITI組又顯著高于IPI組。
　　 1.6各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組、ITI組和IPI組IκB-α蛋白含量均較NC組減少，差異有

21、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組和ITI組IκB-α磷酸化水平均較NC組顯著增加，而IPI組和NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組和ITI組NF-κBp65磷酸化水平均較NC組顯著增加，而IPI組和NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ITA組IκB-α蛋白含量均顯著低于ITI組和IPI組，而ITI組又顯著低于IPI組。ITA組IκB-α磷酸化水平顯著高于ITI組和IPI組，ITI組又顯著高于IPI組。ITA組和ITI組肺組織NF-κ Bp65磷酸化水平均顯著高

22、于IPI組，而ITA和ITI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2 NBD預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠過(guò)度炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激失衡的影響
　　 2.1各組小鼠肺組織病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組病理評(píng)分顯著高于對(duì)照組。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD低中高劑量組病理評(píng)分均較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組和高劑量組病理評(píng)分均顯著低于NBD低劑量組（P=0.038和P=0.004），而NBD高劑量

23、組與中劑量組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組和NBD陰性對(duì)照組小鼠各肺葉均存在彌漫性的肺泡間隔增厚、肺泡壁破壞以及肺泡塌陷，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與出血，血管床不同程度破壞。給予低中高劑量NBD預(yù)處理0.5h，可以顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理?yè)p傷，并且NBD的肺組織保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增強(qiáng)。
　　 2.2各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2

24、h后，模型組TNF-α和IL-1β濃度均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD低中高劑量組TNF-α和IL-1β濃度均較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD低中高劑量組間TNF-α濃度呈濃度依賴(lài)性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組和高劑量組IL-1β濃度均低于NBD低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NBD高劑量組與中劑量組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.3各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄

25、水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD中劑量和高劑量組TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較模型組顯著降低。NBD低中高劑量組間TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈濃度依賴(lài)性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.4各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

26、LPS給藥2h后，模型組IκB-α蛋白含量較對(duì)照組顯著減少，而IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平均較對(duì)照組顯著增加。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD低中高劑量組IκB-α蛋白含量均較模型組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平均較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組IκB-α蛋白含量較NBD低劑量組顯著增高，而NBD高劑量組與低中劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD低中高劑量組間肺組織IκB-α

27、和NF-κ Bp65蛋白磷酸化水平呈濃度依賴(lài)性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.5各組小鼠肺組織SOD、T-AOC和MDA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組SOD和T-AOC濃度均較對(duì)照組顯著降低，而MDA濃度較對(duì)照組顯著增高。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD中劑量組和高劑量組SOD和T-AOC濃度均較模型組顯著增高，而NBD低劑量組與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD低中高劑量組MDA濃度均較模型組降低，差異有

28、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組和高劑量組MDA濃度均較NBD低劑量組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NBD中劑量和高劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.6各組小鼠肺組織NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較對(duì)照組顯著升高。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD低中高劑量組NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較模型組降低，差異有

29、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組和高劑量組NOX1、NOX2和NOX4mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于NBD低劑量組，而NBD高劑量組與中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.7各組小鼠肺組織NOX1、NOX2和NOX4蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組NOX1、NOX2和NOX4蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予NBD預(yù)處理0.5h，NBD中劑量組和高劑量組肺組織NOX1和NOX2蛋白表達(dá)水平均較模型

30、組顯著減少，而NBD低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NBD低中高劑量組NOX4蛋白表達(dá)水平均較模型組顯著減少。NBD低中高劑量組間NOX1蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD高劑量組NOX2蛋白表達(dá)水平較NBD低劑量組顯著降低，而NBD中劑量與與低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NBD中劑量組和高劑量組NOX4蛋白表達(dá)水平均較NBD低劑量組顯著降低，而NBD中劑量和高劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3

31、、PS聯(lián)合NBD預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠過(guò)度炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究
　　 3.1各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組TNF-α和IL-1β濃度均較對(duì)照組顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS組、NBD組和PS+NBD組TNF-α和IL-1β濃度均較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS+NBD組TNF-α和IL-1β濃度均較PS組顯著降低，而PS+NBD組與NBD組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異

32、。
　　 3.2各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平較均較對(duì)照組顯著升高。PS組、NBD組和PS+NBD組TNF-α和IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于模型組。PS+NBD組TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較PS和NBD單藥組顯著降低，而IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅較PS組顯著降低，與NBD組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

33、 3.3各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κ Bp65蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組IκκB-α含量較對(duì)照組顯著減少，而IκB-α和NF-κ Bp65磷酸化水平均較對(duì)照組顯著增加。PS組、NBD組和PS+NBD組IκB-α含量均較模型組顯著增加，而IκB-α和NF-κBp65磷酸化水平均較模型組顯著降低。PS+NBD組IκB-α含量較PS組顯著增加，而與NBD組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS+NB

34、D組IκB-α和NF-κ Bp65磷酸化水平均較PS和NBD組顯著降低，而PS組和NBD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.4各組小鼠肺組織P38MAPK、ERK1/2和.JNK蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS給藥2h后，模型組P38MAPK、ErK1/2和JNK磷酸化水平均較對(duì)照組顯著增加。PS組肺組織P38MAPK磷酸化水平較模型組顯著減少，而PS+NBD組和NBD組與模型組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PS組ERK1/2

35、磷酸化水平與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PS+NBD組和NBD組均較模型組顯著降低。PS組、NBD組和PS+NBD組JNK磷酸化水平均較模型組顯著降低，而PS組、NBD組和PS+NBD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.與氣管內(nèi)滴入和腹腔注射相比，氣管內(nèi)霧化能使LPS更加均勻地分布于小鼠肺內(nèi)，顯著增加LPS與肺組織的有效接觸面積，引起更強(qiáng)烈的炎癥放大反應(yīng)，造成更嚴(yán)重的肺組織損傷，從而更接近ALI病理過(guò)程，

36、而且氣管內(nèi)霧化LPS具有手術(shù)創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，是復(fù)制ALI小鼠模型的優(yōu)選方案。
　　 2.給予適當(dāng)劑量的NBD預(yù)處理，可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的正反饋性放大，進(jìn)而明顯減輕肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞。
　　 3.NBD聯(lián)合PS預(yù)處理，不僅可以顯著下調(diào)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中MAPKs磷酸化水平，抑制NF-κB環(huán)路的正反饋性放大，減少TNF-α和IL-1β等促炎介質(zhì)表