酪氨酸激酶抑制劑對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2樣極化的影響.pdf

1、科學(xué)研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化在各種類型腫瘤的血管生成、腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移等過程中扮演了重要的角色。在腫瘤組織中，巨噬細(xì)胞的不同作用支持著腫瘤的生長或是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。一些臨床研究顯示，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（簡稱TAMs）的高度浸潤與乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌以及宮頸癌的臨床不良預(yù)后之間有相關(guān)性。之前的假說提出了TAMs參與到機(jī)體的抗腫瘤作用當(dāng)中，但最近許多臨床和科學(xué)研究已經(jīng)證明在大多數(shù)情況下TAMs會促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)程。越

2、來越多的研究表明，TAMs具有不同的作用，既可以增加細(xì)胞毒性化療藥物、癌細(xì)胞靶向抗體及免疫治療藥物的抗腫瘤功效，也有可能發(fā)揮對抗藥物的作用。由于TAMs在癌癥的生長與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著多重的作用，因此，發(fā)展靶向于這些細(xì)胞的新策略是非常重要的。而且，靶向TAMs將是一項有前途的治療策略。通常靶向TAMs主要有兩個策略，一方面是減少TAMs在腫瘤組織中的密度;另一方面則是將TAMs的類型從促腫瘤型轉(zhuǎn)化殺滅腫瘤類型。然而，靶向TAMs策略距離在臨床

3、的應(yīng)用仍然有一定的距離，很多問題仍然未解決。因此，有許多實驗仍在開展，目前大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示該策略可以使腫瘤體積大幅度減小具有較好的治療效果，這些都將為臨床應(yīng)用做鋪墊。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、趴伤苄院彤愘|(zhì)性是巨噬細(xì)胞的主要特點，因此在腫瘤微環(huán)境中不同的刺激下，TAMs會極化成為不同類型，發(fā)揮預(yù)防腫瘤或是促進(jìn)腫瘤的生長的不同作用。在腫瘤中，巨噬細(xì)胞主要極化為兩種不同的表型，分別是經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。在非惡性腫瘤中，腫

4、瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要大多數(shù)經(jīng)由干擾素γ（IFN-γ）或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)極化成為M1型巨噬細(xì)胞，具有釋放促炎癥細(xì)胞因子、Th1抗原呈遞以及促進(jìn)腫瘤溶解的功能。相反地，M2型極化的巨噬細(xì)胞具有促腫瘤和抗炎的活性。IL-4，IL-13，IL-10和糖皮質(zhì)激素均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化。M2型巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步分為三種不同的亞型M2a，M2b和M2c型巨噬細(xì)胞。這些極化的不同亞型取決于特定類型配體與受體的相互作用，在調(diào)節(jié)炎癥、免疫和腫瘤抑制

5、中發(fā)揮極其重要的作用。Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-13可誘導(dǎo)M2a型極化;M2b型主要由免疫復(fù)合物TLRs激活;糖皮質(zhì)激素和IL-10可激活M2c型巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞高度表達(dá)IL-10，IL-1誘餌受體以及IL-1Rα，少量分泌CCL-22，CCL-17，低表達(dá)IL-12。IL-13受體激活STAT6信號通路進(jìn)而增加M2型極化基因轉(zhuǎn)錄如甘露糖受體（Mrc1，幾丁質(zhì)酶3(Chil3，Ym1，抵抗素類似物（Retnla和Fizz

6、1，這些都是M2型極化所必不可少的。TAMs在腫瘤的發(fā)展過程中與M2型巨噬細(xì)胞功能類似，具有抗炎功能，能夠促進(jìn)血管生成和組織重構(gòu)以及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。STAT6是IL-4/IL-13介導(dǎo)的M2型極化中主要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠顯著調(diào)節(jié)炎癥與過敏反應(yīng)間的平衡。STAT6調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)基因例如Arg1，Mrc1以及Ym1的表達(dá)。因此M2型極化的TAMs是很有前途的輔助抗癌治療的靶點。然而，TAMs和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用相當(dāng)?shù)膹?fù)雜，

7、而且目前仍未被清楚地闡明。最重要地，TAMs能否增加腫瘤生長仍然存在爭議。過去的幾十年中，一些新型的靶向TAMs的抗癌療法，例如化療、靶向治療、聯(lián)合治療和免疫治療已經(jīng)發(fā)展了起來并且進(jìn)行著廣泛的實驗。此外，重新極化為M1型巨噬細(xì)胞，減少TAMs的募集，抑制TAMs的M2型極化以及阻斷M2型TAMs的促腫瘤功能，都或?qū)⒊蔀榭鼓[瘤的新策略。靶向治療是指新一代旨在干擾特定分子靶點的抗癌藥物，這些靶點通常是一些在腫瘤的生長與發(fā)展中具有重要作用的蛋

8、白。
　?、评野彼峒っ甘且活惪梢哉{(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、遷移、分化和死亡的激酶，因此是一個很有前途的癌癥治療靶點。在本課題研究中，我們考察酪氨酸激酶小分子抑制劑(TKI)如達(dá)沙替尼，厄洛替尼，吉非替尼和拉帕替尼是否具有抑制TAMs的M2型極化的活性。最初我們將這四個化合物作用在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，小鼠骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞BMDMs，小鼠路易斯肺癌細(xì)胞LLCs和人肝癌細(xì)胞HepG2上，在這些細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞存活實驗，考察它們細(xì)

9、胞增殖的抑制作用。將一系列梯度濃度的藥物作用細(xì)胞上，篩選出在這四種細(xì)胞中均無嚴(yán)重增殖抑制作用的最佳濃度。達(dá)沙替尼是一種三磷酸腺苷的競爭性抑制劑，主要作為Src家族和Ab1酪氨酸激酶的雙重抑制劑。它也是一種非常有效的ephrin受體家族成員KIT和PDGF受體的抑制劑。在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼在Raw264.7和BMDMs細(xì)胞上均能有效抑制由IL-13所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化。當(dāng)Raw264.7細(xì)胞經(jīng)10ng/ml的IL-13

10、給藥72h，細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206的的表達(dá)明顯上調(diào)。當(dāng)同時給予0.038μM的達(dá)沙替尼后表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)有一定程度的下降。相似地，在BMDMs細(xì)胞中也能觀察到表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)有類似的變化，其表達(dá)隨達(dá)沙替尼的濃度的升高而降低。為了進(jìn)一步證實達(dá)沙替尼在M2型極化中的作用，采用了實時定量PCR的方法檢測M2型標(biāo)記基因的mRNA的水平。與IL-13單用組相比，同時給予0.038μM的達(dá)沙替尼后，M2型標(biāo)志基因Mrc1、 Y

11、m1、Fizz1和Arg1的mRNA水平顯著降低。這些結(jié)果證實達(dá)沙替尼可抑制IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化。
　?、嵌蚵逄婺崾橇硪环N酪氨酸激酶抑制劑，主要用于治療已經(jīng)擴(kuò)散到身體其他部位，具有特定類型表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC。在本課題中，我們研究了厄洛替尼對IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。在體外實驗中，厄洛替尼可抑制巨噬細(xì)胞M2型極化，具體表現(xiàn)為下調(diào)了M2表面標(biāo)志物和M2型標(biāo)志基因的m

12、RNA水平。由于這個化合物具有良好的抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的活性，因此我們在不同的腫瘤細(xì)胞中開展進(jìn)一步體外以及體內(nèi)研究。在腫瘤微環(huán)境中IL-13可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生替代活化的M2型極化。IL-13與其受體的結(jié)合主要激活了STAT6和PI3K兩條信號通路。然而，IL-13在巨噬細(xì)胞極化方面的作用仍然具有爭議的。TAMs的募集，特別是M2型極化的TAMs在腫瘤發(fā)生中的作用非常重要，因此是腫瘤治療中非常有吸引力的靶點。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)吉非替尼

13、對IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化具有抑制作用。
　?、燃翘婺?，一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑，是一種小分子藥物，被批準(zhǔn)用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。它對多種腫瘤細(xì)胞和大部分小鼠移植瘤模型均具有良好的抗腫瘤活性。在體外實驗中，我們證明了吉非替尼能夠顯著抑制由IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的M2型極化，主要表現(xiàn)為M2表面標(biāo)記物CD206和CD163的下調(diào)和M2型標(biāo)記基因Mrc1，Arg1，Ym1和Fizz1的mRNA水平的下調(diào)。

14、進(jìn)一步，我們通過劃痕實驗測定不同條件培養(yǎng)基對LLCs細(xì)胞的運(yùn)動能力的影響，從而分析吉非替尼對巨噬細(xì)胞促血管生成功能的影響。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-13處理的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在24h的時候能夠促進(jìn)LLC細(xì)胞的運(yùn)動能力，而同時給予IL-13和吉非替尼合用的條件培養(yǎng)基組并沒有這個現(xiàn)象，單用吉非替尼處理的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基也沒有這個效果。通過transwell實驗考察LLC和RAW264.7細(xì)胞在不同條件培養(yǎng)基中的遷移能力的變化，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)

15、IL-13處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)LLC和RAW264.7細(xì)胞的遷移，而同時給予吉非替尼組的條件培養(yǎng)基沒有該促進(jìn)作用。緊接著，我們發(fā)現(xiàn)，吉非替尼在抑制IL-13誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化過程中，抑制STAT6的磷酸化。巨噬細(xì)胞極化主要通過PI3K/Akt、Mapk/Erk和p38通路。而吉非替尼也可以降低Akt，Erk1/2，P38的磷酸化。AMPKα是小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)的主要亞基，我們進(jìn)一步考察在IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化

16、過程中，給予或是不給予吉非替尼，AMPKα和其下游信號通路ACC磷酸化水平的變化。在RAW264.7細(xì)胞中，給予IL-13并不會影響AMPKα和ACC蛋白的磷酸化水平。然而吉非替尼給予后，則能顯著引起AMPKα和ACC的磷酸化水平上調(diào)，同時增加IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化中AMPKα和ACC的磷酸化。在體內(nèi)實驗中，我們證明了吉非替尼通過抑制腫瘤組織中巨噬細(xì)胞M2型極化從而有效地抑制了LLC腫瘤的轉(zhuǎn)移。吉非替尼能夠顯著降低腫瘤組織中

17、CD206陽性細(xì)胞的百分比和巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記基因Mrc1，Arg1和Fizz1的mRNA水平，但不影響腫瘤生長以及不改變腫瘤組織TAMs的數(shù)量。與對照組相比，吉非替尼顯著降低了CD68，CD206陽性細(xì)胞的比例，并且減少了M2型極化的巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤。我們的研究表明，吉非替尼在體內(nèi)和體外均能有效地抑制巨噬細(xì)胞M2型極化并且顯著降低Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移。因此，我們認(rèn)為吉非替尼可以通過影響巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特點調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移部位的微

18、環(huán)境，從而為吉非替尼抗腫瘤功能闡明了新的機(jī)制。本課題的研究揭示了吉非替尼新的作用機(jī)制，為提高肺癌治療效果提供新的思路，在未來可以通過抑制巨噬細(xì)胞M2型極化治療肺癌。
　　⑸肝癌(HCC)與炎癥高度相關(guān)。在HCC微環(huán)境的髓樣細(xì)胞中，均存在著大量德爾腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC，而且常與不良預(yù)后有關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAMs及其啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝細(xì)胞癌的治療中是潛在的靶點。在腫瘤環(huán)境中MMP-9表達(dá)的增加被

19、認(rèn)為可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜，釋放基質(zhì)結(jié)合生長因子和促腫瘤生長因子從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和血管生成能力。IL-13被確定為誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞替代型極化的典型細(xì)胞因子。為了建立巨噬細(xì)胞替代型極化的體外模型，我們在RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入10ng/ml的IL-13。在實驗中，我們根據(jù)M2型表面標(biāo)記物CD206和CD163的表達(dá)降低確定拉帕替尼能夠顯著抑制IL-13所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化。有研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠分泌

20、MMP-9，不過IL-13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和MMP-9產(chǎn)生之間的聯(lián)系卻并沒有明確的報道。隨后，在肝癌細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)IL-13可以增加MMP-9產(chǎn)生以及M2型標(biāo)記基因Arg1，Mrc1，Ym1，IL10，F(xiàn)izz1和CCL2的表達(dá)增加。有趣的是，在實驗中若細(xì)胞沒有被IL-13活化則拉帕替尼對MMP-9的產(chǎn)生沒有影響。拉帕替尼抑制IL-13誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的M2型極化。IL-13信號通路可以激活STAT6的磷酸化，在M2型極化中

21、具有重要的作用。此外，Arg-1的表達(dá)被證實是由STAT6決定的。拉帕替尼隨著時間的推移顯著降低Arg-1的表達(dá)。進(jìn)一步我們通過western blot證實Arg1與Mrc1表達(dá)水平的變化。拉帕替尼可以顯著地降低IL-13誘導(dǎo)的Mrc1和Arg1的表達(dá)。這些體外實驗結(jié)果表明，拉帕替尼通過STAT6依賴途徑顯著地抑制IL-13誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化。PI3K/Akt通路的激活與腫瘤的存活率，侵襲能力和多種腫瘤的不良預(yù)后有著密切的聯(lián)系。我

22、們發(fā)現(xiàn)拉帕替尼有效地降低Akt的磷酸化水平。進(jìn)一步的侵襲實驗中，在與給予拉帕替尼作用的RAW264.7條件培養(yǎng)基共孵育后，可以減少肝癌細(xì)胞的血管生成以及降低其轉(zhuǎn)移能力。我們考察了拉帕替尼對巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用的功能的影響。分別單獨(dú)或者共同給予IL-13和拉帕替尼作用于巨噬細(xì)胞72小時，然后更換為新鮮無血清培養(yǎng)基24小時后，將各組的上清收集起來作為條件培養(yǎng)基。為了排除條件培養(yǎng)基對腫瘤存活的影響，我們將條件培養(yǎng)基作用于HepG2細(xì)胞2

23、4h，并進(jìn)行細(xì)胞存活分析。結(jié)果顯示，四個組別之間對肝癌細(xì)胞HepG2存活的作用并沒有顯著差異，均不影響其存活。給予IL-13刺激的巨噬細(xì)胞組的條件培養(yǎng)基在24h時顯著促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的遷移，而同時給予拉帕替尼合用組的條件培養(yǎng)基則沒有這樣的現(xiàn)象，同樣地，單用拉帕替尼的組也沒有此現(xiàn)象。拉帕替尼減少了RAW264.7細(xì)胞或骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs)中Arg1的表達(dá)。使用骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs)證實了拉帕替尼可以下調(diào)M2型標(biāo)志基因

24、Mrc1，Arg1，Ym1，F(xiàn)izz1，CCL2的mRNA表達(dá)水平以及可以減少M(fèi)MP-9的產(chǎn)生。結(jié)果表明，拉帕替尼可能通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中巨噬細(xì)胞蛋白酶的表達(dá)水平以及M2型極化從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果還表明，拉帕替尼可能作用于IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生的促腫瘤侵襲以及腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用。巨噬細(xì)胞極化與酪氨酸激酶抑制劑抗腫瘤效果的相關(guān)性。將M2型極化盡可能轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型極化會是對抗實體瘤的有效治療手段?？偠灾?，靶向