肝癌中BVES低表達(dá)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其與促腫瘤因子Netrin-1作用關(guān)系的研究.pdf

1、目的:肝癌死亡原因主要為侵襲轉(zhuǎn)移。肝癌侵襲轉(zhuǎn)移可分為多個階段,包括細(xì)胞間黏附下降、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤細(xì)胞遷移、外侵以及遠(yuǎn)處定植等環(huán)節(jié)。BVES是一個具有三次跨膜結(jié)構(gòu)的黏附蛋白,研究發(fā)現(xiàn)其在維持上皮細(xì)胞完整性及調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動過程中具有重要作用,而這兩方面也正是目前腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)。最近有研究報道BVES對一些上皮來源腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,但具體的作用機(jī)制及上游調(diào)控因子還未闡明,BVES對肝癌的作用,尤其是肝癌細(xì)胞EMT的作用尚無報

2、道。本實驗首先研究BVES對肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用,結(jié)合我們研究小組之前關(guān)于促腫瘤因子Netrin-1的研究,進(jìn)一步探討Netrin-1與BVES的作用關(guān)系及可能的分子機(jī)制。
　　方法:應(yīng)用qRT-PCR、Westernblot及免疫組化方法檢測21對肝癌手術(shù)標(biāo)本癌及癌旁組織中BVES的表達(dá)。RT-PCR方法檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中BVES的表達(dá)。構(gòu)建針對BVESmRNA的siRNA(BVESsiRNA)及陰性對

3、照siRNA(ControlsiRNA)。在Huh7肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染BVES干擾片段后,qRT-PCR和Westernblot方法測定干擾效率及上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E鈣粘素(E-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)變化;qRT-PCR進(jìn)一步檢測Twist1、Snail1、MMP2/MMP9和IL-6的表達(dá);觀察肝癌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架改變;用Transwell檢測抑制BVES后肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力變化。觀測過

4、表達(dá)Netrin-1對肝癌細(xì)胞BVES表達(dá)的影響。給予Netrin-1蛋白作用肝癌細(xì)胞觀測其對肝癌細(xì)胞BVES表達(dá)的影響。Westernblot檢測Netrin-1蛋白對PI3K/Akt通路信號分子表達(dá)的作用,PI3K抑制劑LY294002預(yù)先處理肝癌細(xì)胞后探討PI3K/Akt通路在Netrin-1對BVES表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用。
　　結(jié)果:在21對病理學(xué)診斷為肝癌及癌旁手術(shù)標(biāo)本中,14例癌旁組織BVESmRNA的表達(dá)明顯高于癌組織,

5、陽性率達(dá)66.7％,免疫組化證實BVES主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。在不同轉(zhuǎn)移潛能肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中,隨著轉(zhuǎn)移潛能增加,BVES表達(dá)減少。在Huh-7肝癌細(xì)胞中干擾BVES后發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin減少68.20±0.72%(p<0.05),間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin增加3.71±0.93倍(p<0.05);形態(tài)學(xué)上觀察到,干擾BVES后,Huh7肝癌細(xì)胞由橢圓形的上皮結(jié)構(gòu)變?yōu)榘w狹長的間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞連接減少,

6、鬼筆環(huán)肽檢測到細(xì)胞骨架發(fā)生重排。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示,干擾BVES后遷移細(xì)胞數(shù)(382±12)個,較對照組(180±10)個明顯增加(P<0.01);侵襲實驗結(jié)果顯示,干擾BVES后穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)(300±15)個,較對照組(120±12)個明顯增加(P<0.01),而24h細(xì)胞增殖無明顯改變。同時發(fā)現(xiàn),干擾BVES后,肝癌細(xì)胞中Twist1、Snail1、MMP2/MMP9及IL-6mRNA表達(dá)均增加。過表達(dá)Netrin-1及加入

7、重組人Netrin-1蛋白后,Huh7肝癌細(xì)胞BVES在mRNA和蛋白水平表達(dá)均減少,且Akt磷酸化增加。抑制Netrin-1下游PI3K/Akt信號通路后,BVES表達(dá)可恢復(fù)。
　　結(jié)論:BVES可能與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān);其低表達(dá)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的作用;肝癌細(xì)胞中BVES受Netrin-1調(diào)控,而PI3K/Akt信號通路可能在這個過程中具有重要作用。深入研究BVES在Netrin-1促進(jìn)的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制,可能為抑制