中期因子誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和血液播散的初步研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)作為肝癌標(biāo)志物，可反映腫瘤負(fù)荷，有助于部分肝癌診斷和療效監(jiān)測(cè)，但對(duì)于預(yù)后預(yù)測(cè)幾無作用。盡管已報(bào)道的其他標(biāo)志物越來越多，但其臨床應(yīng)用價(jià)值或者有限，或者需要廣泛驗(yàn)證。因此，進(jìn)一步鑒定能判斷肝癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物，發(fā)展能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的檢測(cè)手段

2、仍是肝癌研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。中期因子(midkine，MK)是一種肝素結(jié)合因子，在包括肝癌在內(nèi)的多種類型惡性腫瘤中高表達(dá)。它直接參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，有望成為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithilial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)變成具有活動(dòng)性的間質(zhì)細(xì)胞的過程。現(xiàn)有的研究表明，EM工程序激活使腫瘤細(xì)胞獲得異常活動(dòng)能力，從而誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展、侵襲、擴(kuò)散

3、，最終形成轉(zhuǎn)移。本研究首先建立檢測(cè)MK的肝素-ELISA方法，通過多種方法學(xué)分析以及臨床肝癌標(biāo)本檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的可行性，并將相同方法學(xué)原理用于MK和PTN(pleiotrophin，多向因子，與MK組成一個(gè)肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族)雙因子總量的初步檢測(cè)，為后續(xù)建立肝素結(jié)合分子群總量檢測(cè)方法積累實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和工作基礎(chǔ)。然后通過體外細(xì)胞研究和臨床標(biāo)本檢測(cè)，建立MK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，初步探討MK通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT促進(jìn)肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的

4、生物學(xué)作用。
　　 研究方法
　　 1.應(yīng)用肝素-抗體雙夾心原理建立檢測(cè)MK的ELISA法，進(jìn)行方法學(xué)研究。
　　 (1)基于MK對(duì)肝素的高親和力，應(yīng)用肝素-抗體雙夾心原理建立檢測(cè)MK的ELISA法。
　　 (2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 (3)分析靈敏度試驗(yàn)。
　　 (4)回收試驗(yàn)。
　　 (5)線性評(píng)價(jià)。
　　 (6)精密度試驗(yàn)。
　　 (7)方法學(xué)比較。
　

5、　 2.應(yīng)用肝素-雙抗體夾心法檢測(cè)MK和PTN雙細(xì)胞因子總量的初步研究。
　　 3.肝癌血清MK含量檢測(cè)。
　　 4.MK誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　 (1)細(xì)胞增殖試驗(yàn)。
　　 (2)細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。
　　 (3)細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)。
　　 (4)Western blot分析。
　　 5.臨床肝癌標(biāo)本MK、EMT分子標(biāo)志物和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulati

6、ng tumor cells，CTCs)檢測(cè)，以及這些指標(biāo)之間的相關(guān)性分析。
　　 (1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中MK表達(dá)。
　　 (2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌組織中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)表達(dá)。
　　 (3)肝癌血液CTCs檢測(cè)。
　　 (4)肝癌組織MK表達(dá)與肝癌血清MK含量、肝癌組織E-cadherin表達(dá)、肝癌血液CTCs含量以及肝癌臨床病理學(xué)特征之間的相

7、關(guān)性分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.建立了檢測(cè)MK含量的肝素-抗體ELISA法，基本符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 (1)生物素化肝素與MK單克隆抗體的最佳工作濃度分別為2μg/mL和0.75μg/mL。
　　 (2)以各濃度的OD450為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.2308x-0.0094，r=0.9973。
　　 (3)分析靈敏度為0.047ng/mL。
　　 (4)

8、MK回收率范圍為90.6～102.0％，平均為96.85±4.04％。
　　 (5)MK濃度在0.096～1.436ng/mL范圍內(nèi)線性良好，得到的線性方程為y=1.1387x+0.011，r=0.998。
　　 (6)批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為6.3～6.9％和9.0～9.8％。
　　 (7)與商品化人MKELISA試劑盒(雙抗體央心法)的檢測(cè)結(jié)果比較，二者之間的差異無顯著性(P=0.058)。線性回歸分

9、析結(jié)果表明，二者之間的相關(guān)性良好(r=0.9779)。
　　 2.MK和PTN雙細(xì)胞因子總量檢測(cè)的初步結(jié)果顯示，應(yīng)用肝素-雙抗體夾心法可檢測(cè)2個(gè)肝素結(jié)合性細(xì)胞因子總量。
　　 3.臨床血清檢測(cè)結(jié)果顯示，20例正常人血清MK含量為(0.259±0.061)ng/mL，85例肝癌血清MK含量為(0.501±0.111)ng/mL，二者之間有顯著差異(P<0.05)。如果將0.382ng/mL設(shè)定為陽性界限，肝癌患者陽性率為8

10、5.9％。
　　 4.MK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的體外試驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 (1)10nMMK刺激培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞可獲得最高的增殖力和最強(qiáng)的侵襲力；
　　 (2)MK刺激的肝癌細(xì)胞發(fā)生了典型的EMT細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞中vimentin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)。
　　 5.臨床肝癌標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果表明：
　　 (1)肝癌組織表達(dá)MK高于配對(duì)癌旁組織；
　　 (2)肝癌血清MK表達(dá)與配對(duì)

11、肝癌組織MK含量正相關(guān)；
　　 (3)肝癌組織MK表達(dá)與TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；
　　 (4)肝癌組織中存在vimentin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。肝癌組織MK表達(dá)與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)(P<0.05)；
　　 (5)80％肝癌患者外周血可檢出CTCs，檢出數(shù)為12.6±13.2。肝癌組織MK表達(dá)與肝癌CTCs正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 建立了檢測(cè)