HBx蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化及其分子機(jī)制初步探討.pdf

1、既往大量研究提示乙肝病毒和肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)發(fā)生關(guān)系密切，然而關(guān)于乙肝病毒對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的研究卻很少；近年來(lái)，鑒于發(fā)現(xiàn)乙肝病毒X基因編碼的HBx蛋白可以激活多個(gè)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的原癌基因(如c-Src等)及轉(zhuǎn)錄因子，HBx蛋白在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用開(kāi)始引起關(guān)注。由于在HBx蛋白所激活的諸多原癌基因/信號(hào)通路中，酪氨酸激酶家族的c-Src是介導(dǎo)上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子

2、之一，因此我們推想：HBx蛋白是否可以通過(guò)激活c-Src來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移呢? 上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)指上皮細(xì)胞獲得了成纖維細(xì)胞樣表型，其特征是細(xì)胞標(biāo)志物改變和細(xì)胞內(nèi)骨架重排等，其結(jié)果是細(xì)胞間粘附減弱、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力大大增強(qiáng)。 為了檢驗(yàn)我們的假想，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先，在肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本上，用免疫組化方法檢測(cè)了

3、HBx、活化型c-src、上皮標(biāo)志物(E-cadherin、β-catenin、α-catenin)、間葉標(biāo)志物(N-cadherin、vimentin、fibronectin)在肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)，并評(píng)價(jià)其臨床意義；然后，構(gòu)建含HBx基因的重組腺病毒載體，包裝產(chǎn)生腺病毒，并進(jìn)一步感染SMMC-7721細(xì)胞。觀察轉(zhuǎn)染HBx基因后的SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)變化，并檢測(cè)上皮標(biāo)志物和間葉標(biāo)志物的表達(dá)情況。再給予c-src激酶抑制劑PP2和

4、陰性對(duì)照PP3，評(píng)價(jià)HBx蛋白是否通過(guò)活化c-Src來(lái)發(fā)揮誘導(dǎo)作用。最后，將腺病毒感染的SMMC-7721細(xì)胞接種到裸鼠皮下和脾臟，評(píng)價(jià)HBx蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。 本組實(shí)驗(yàn)主要的結(jié)果及結(jié)論如下： 1.76例肝細(xì)胞癌組織中，有52例(52/76，68.4％)HBx表達(dá)陽(yáng)性，有38例(38/76，50％)活化型c-Src表達(dá)陽(yáng)性；上皮標(biāo)志物在肝癌細(xì)胞膜的表達(dá)情況是，26例E-cadherin表達(dá)缺失(2

5、6/76，34.2％)，18例α-catenin(18/76，23.7％)表達(dá)缺失，15例β-catenin(15/76，19.7％)表達(dá)缺失；間葉標(biāo)志物在肝癌細(xì)胞漿的表達(dá)情況是，N-cadherin有42例(42/76，55.3％)表達(dá)陽(yáng)性，Vimentin有9例(9/76，11.8％)表達(dá)陽(yáng)性，F(xiàn)ibronectin有35例(35/76，46.1％)表達(dá)陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析顯示，E-cadherin和β-catenin等上皮標(biāo)志物在肝癌細(xì)

6、胞膜上的表達(dá)缺失，以及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等間葉標(biāo)志物在肝癌細(xì)胞漿中的陽(yáng)性表達(dá)均與腫瘤靜脈侵襲等相關(guān)，這就提示在肝癌細(xì)胞中，上皮標(biāo)志物的表達(dá)減弱和間葉標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)，可能協(xié)同促進(jìn)了肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移；統(tǒng)計(jì)分析還表明，HBx表達(dá)和c-Src活化顯著相關(guān)，并且兩者均與E-cadherin表達(dá)缺失和N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)；這就提示，在肝癌細(xì)胞中，HBx可能通過(guò)活化c-Src同時(shí)調(diào)控了上皮標(biāo)志

7、物和間葉標(biāo)志物的表達(dá)。 2.經(jīng)過(guò)基因測(cè)序和酶切鑒定，HBx基因正確插入到所構(gòu)建的重組腺病毒載體中，熒光顯微鏡下包裝細(xì)胞中見(jiàn)到綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)；因此我們成功構(gòu)建了攜帶HBx基因的重組腺病毒載體及其陰性對(duì)照空載體；在腺病毒感染的靶細(xì)胞中，熒光顯微鏡下可見(jiàn)GFP表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)到HBxmRNA表達(dá)，Westernblotting和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)到HBx蛋白表達(dá)。這說(shuō)明，我們制備的重組腺病毒成功感染肝癌細(xì)胞株SM

8、MC-7721，目的基因得到高表達(dá)。 3.腺病毒感染SMMC-7721細(xì)胞一周后，空載體對(duì)照組細(xì)胞維持母細(xì)胞的上皮樣表型，而含HBx基因的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形，細(xì)胞離散；給予PP2后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞由梭形恢復(fù)原來(lái)的上皮表型，而給予PP3后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。這初步說(shuō)明，HBx蛋白可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化，而c-Src活化在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過(guò)RT-PC、Westernblotting和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法進(jìn)一步檢測(cè)

9、轉(zhuǎn)染HBx基因后，肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物E-cadherin和α-catenin在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，而間葉標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予PP2后能夠逆轉(zhuǎn)上述HBx基因轉(zhuǎn)染的效應(yīng)，而給予PP3后無(wú)明顯變化。這進(jìn)一步提示，HBx蛋白通過(guò)活化c-Src誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生了上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化。 4.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

10、實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染HBx基因的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞；腺病毒感染的細(xì)胞接種到裸鼠脾臟后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形成的肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著多于對(duì)照組。因此上述體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示，HBx蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化后，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力提高。 5.轉(zhuǎn)染HBx基因后，SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移，倍增時(shí)間縮短，說(shuō)明HBx蛋白促進(jìn)了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因的實(shí)驗(yàn)

11、組細(xì)胞在裸鼠皮下和脾臟接種后，形成的腫瘤體積和重量均顯著大于對(duì)照組；因此，HBx蛋白促進(jìn)了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1.HBx蛋白可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化，其特征是肝癌細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為梭形，E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等間葉標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng)；而且發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化后，肝癌細(xì)胞在體內(nèi)、體外的運(yùn)動(dòng)和侵襲轉(zhuǎn)移能