HCVc蛋白誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化及其分子機(jī)制的初步探討.pdf

1、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染與膽管癌發(fā)生關(guān)系密切。HCV核心區(qū)基因編碼的核心蛋白(hepatitis C viruscore protein，HCVc)，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白的相互作用、致癌及脂質(zhì)代謝中起著重要作用，它可以通過(guò)激活NF-KB信號(hào)通路參與膽管癌的發(fā)生。上皮一間葉樣表型轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EM

2、T)是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤的重要生物學(xué)現(xiàn)象，其實(shí)質(zhì)是上皮細(xì)胞獲得了成纖維細(xì)胞樣表型，特征是細(xì)胞標(biāo)志物改變和細(xì)胞內(nèi)骨架重排，結(jié)果是細(xì)胞間粘附減弱、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力大大增強(qiáng)。鑒于NF-kB信號(hào)通路在誘導(dǎo)EMT過(guò)程中的重要作用以及EMT可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，我們研究了HCVc蛋白與膽管癌細(xì)胞EMT的關(guān)聯(lián)性，旨在證明HCVc蛋白可以誘導(dǎo)膽管癌EMT發(fā)生從而促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性。賴氨酰氧化酶樣2基因(lysyl oxidase-like

3、2enzyme gene，LOXL2)是EMT的關(guān)鍵因子之一，由于其在膽管癌組織中存在著較高表達(dá)，并與膽管癌組織的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，我們同時(shí)探討了LOXL2在HCVc蛋白誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞EMT中的作用，旨在初步闡明膽管癌EMT的發(fā)生機(jī)理。 為了檢驗(yàn)我們的假想，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先，在膽管癌組織標(biāo)本上，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了HCVc蛋白、上皮性標(biāo)志物(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)、間葉

4、性標(biāo)志物(N-cadherin、vimentin、fibronectin)在膽管癌癌組織中的表達(dá)，并評(píng)價(jià)其臨床意義；然后，轉(zhuǎn)染含有HCVc全長(zhǎng)基因序列的重組質(zhì)粒載體到膽管癌細(xì)胞QBC939中，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的變化，并檢測(cè)細(xì)胞上皮性標(biāo)志物、間葉性標(biāo)志物及LOXL2的表達(dá)情況；最后，通過(guò)共轉(zhuǎn)染HCVc基因和LOXL2 shRNA基因到QBC939中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上皮性標(biāo)志物、間葉性標(biāo)志物的表達(dá)變化情況，以評(píng)價(jià)LOXL2在HCVc蛋白誘

5、導(dǎo)膽管癌細(xì)胞EMT中的作用。 結(jié)果： 1.34例膽管癌組織中HCVc蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率是47.1％，上皮性標(biāo)志物的缺失率分別是E-cadherin55.9％，a-catenin70.6％，β-catenin55.9％，間葉性標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率分別是N-cadherin50％，vimentin44.1％，fibronectin55.9％，HCVc蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與E-cadherin和α-catenin的缺失及N-cadher

6、in、vimentin和fibronectin的陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)(P值均<0.05)，并與膽管癌組織的淋巴結(jié)及其它臟器轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P值均<0.05)。這些結(jié)果提示，HCVc蛋白可能通過(guò)誘導(dǎo)膽管癌組織上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進(jìn)了膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。 2.經(jīng)過(guò)基因測(cè)序鑒定，PGST-HCVc195含有HCVc全長(zhǎng)基因序列，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，RT-PCR及real-time PCR檢測(cè)到HCVc mRNA的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)和W

7、esternblotting檢測(cè)到HCVc蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，HCVc基因成功地轉(zhuǎn)染到膽管癌細(xì)胞QBC939中，目的基因得到高表達(dá)。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞5天后，空載體對(duì)照組細(xì)胞維持母細(xì)胞的上皮樣表型，而表達(dá)HCVc基因的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形，變得離散；通過(guò)RT-PCR、real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting等方法進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染HCVc基因后膽管癌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)上皮性標(biāo)志物E-c

8、adherin在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，同時(shí)間葉性標(biāo)志物Vimentin、Fibronectin在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，這進(jìn)一步提示，HCVc蛋白誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生了上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化。 4.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HCVc基因的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力顯著強(qiáng)于空載體對(duì)照組細(xì)胞，這提示，HCVc蛋白誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化后，提高了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。 5.轉(zhuǎn)染PG

9、ST-HCVc195重組質(zhì)粒及PGEX-3ks空載體的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組QBC939細(xì)胞48小時(shí)后，通過(guò)real-time PCR和Western blotting的方法檢測(cè)LOXL2基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染HCVc基因的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LOXL2基因和蛋白的表達(dá)水平明顯高于空載體對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明HCVc基因可能上調(diào)了LOXL2基因轉(zhuǎn)錄，增加了其蛋白的表達(dá)。 6.經(jīng)過(guò)酶切和基因測(cè)序鑒定，證明LOXL2 shRNA基因正確插入到所構(gòu)

10、建的重組質(zhì)粒載體中，在其與HCVc基因共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，熒光顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，通過(guò)real-time PCR和Western blotting的方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均有HCVc mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)，通過(guò)real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting的方法也檢測(cè)到LOXL2 mRNA及蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯低于空載體對(duì)照組，這說(shuō)明，HCVc及LOXL2 shRNA基因成功地轉(zhuǎn)

11、染膽管癌細(xì)胞QBC939，目的基因得到較好的表達(dá)或沉默。 7.重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，通過(guò)real-time PCR和Western blotting的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HCVc和LOXL2 shRNA基因后，膽管癌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志物性E-cadherin在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，而間葉性標(biāo)志物Vimentin、Fibronectin在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，結(jié)果提示，LOXL2在H

12、CVc蛋白誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮一間葉樣表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。 結(jié)論： 1.HCVc蛋白可以誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮一間葉樣表型轉(zhuǎn)化，其特征是膽管癌細(xì)胞形態(tài)由圓形、橢圓形、多角形，排列緊密，轉(zhuǎn)化為梭形，離散；E-cadherin等上皮性標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，Vimentin、Fibronectin等間葉性標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng)，而且發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化后，膽管癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著提高。 2.LOXL2在HCVc