SIRT1在骨橋蛋白誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：肺癌是世界癌癥相關(guān)死亡的首要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small celllung cancer, NSCLC)占原發(fā)肺癌的80％-85％。大多數(shù)NSCLC患者初診時已屬中晚期。NSCLC的不良預(yù)后很大程度上歸咎于其較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，使其細(xì)胞間黏附力減低，細(xì)胞遷移、侵襲力增強的一種可逆的表型轉(zhuǎn)化過程，在腫瘤侵

2、襲、轉(zhuǎn)移、耐藥方面發(fā)揮重要作用。因此，探究調(diào)控非小細(xì)胞肺癌EMT的分子機制，逆轉(zhuǎn)EMT過程，對改善患者預(yù)后有重大意義。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種分泌性糖蛋白，可由腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在腫瘤形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn):OPN在人類多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等，包括非小細(xì)胞肺癌。此外，在非小細(xì)胞肺癌，肝細(xì)胞癌，胃癌等多種惡性腫瘤中，腫瘤組織OPN表達(dá)水平的升高與腫

3、瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。近期研究顯示，OPN可誘導(dǎo)乳腺癌、肝癌細(xì)胞EMT,但其誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞EMT的分子機制尚未明確。探究OPN誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞EMT的分子機制，對于找到OPN高表達(dá)的患者的潛在特異性治療靶點有重要意義。SIRT1是一種去乙酰化酶，研究表明多種細(xì)胞因子，如TGF-β，TNF-α，IL-1β均可通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)，調(diào)控多種病理生理過程，而OPN是否會對SIRT1表達(dá)產(chǎn)生影響尚不明確。SIRT1參與調(diào)控與腫瘤進(jìn)

4、展相關(guān)的多條信號通路。然而，文獻(xiàn)顯示SIRT1在腫瘤EMT中的作用具有兩面性，一方面在乳腺癌、口腔鱗癌中SIRT1抑制腫瘤細(xì)胞EMT;另一方面，在前列腺癌中，SIRT1又可促進(jìn)EMT。SIRT1在EMT中的作用與其所屬的腫瘤微環(huán)境及下游作用靶點密切相關(guān)。OPN作為腫瘤微環(huán)境中的重要蛋白，其與SIRT1的關(guān)系在腫瘤中尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究旨在探討OPN對SIRT1表達(dá)的影響及在高水平OPN條件下，SIRT1對OPN誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞E

5、MT的影響，并進(jìn)一步探討這一作用可能的信號傳導(dǎo)機制。
　　方法：⑴實時熒光定量PCR（簡稱定量PCR）和ELISA測定4種人NSCLC細(xì)胞株和人正常肺上皮細(xì)胞株中OPN的mRNA表達(dá)和蛋白分泌水平。選擇基礎(chǔ)OPN分泌水平較低的兩種NSCLC細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。⑵不同濃度(0-400 ng/ml)的OPN處理NSCLC細(xì)胞24 h，定量PCR和Western blot測定SIRT1和E-鈣粘蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平，Wester

6、n blot測定乙?；疦F-κB(核因子-κB)p65和總NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平。⑶應(yīng)用SIRT1過表達(dá)慢病毒載體（LV-SIRT1）構(gòu)建過表達(dá)SIRT1的A549和NCI-H358非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，同時設(shè)立感染陰性對照病毒載體(LV-NC)的細(xì)胞進(jìn)行對照。定量PCR和Western blot測定感染后96 h的SIRT1表達(dá)情況。⑷將感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358細(xì)胞分別應(yīng)用400 ng/ml

7、 OPN或等量對照溶劑（Control buffer, CB）處理，觀察細(xì)胞形態(tài)。⑸將感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358細(xì)胞分別應(yīng)用400 ng/ml OPN或等量CB處理，24 h后應(yīng)用定量PCR和Western blot測定EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平。Western blot測定乙?；疦F-κB p65和總NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平。⑹將感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358細(xì)胞

8、分別應(yīng)用不同濃度(0-400 ng/ml) OPN處理24 h，CCK-8測定細(xì)胞增殖能力;將感染后的細(xì)胞應(yīng)用400 ng/ml OPN或等量CB處理0，12，24，48 h，CCK-8再次測定細(xì)胞增殖能力。⑺將感染LV-SIRT1和LV-NC的A549和NCI-H358細(xì)胞分別應(yīng)用400 ng/mlOPN或等量CB處理48 h，劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力，Transwell侵襲實驗測定細(xì)胞侵襲能力。⑻將感染LV-SIRT1或LV-NC的

9、A549和NCI-H358細(xì)胞分別應(yīng)用400 ng/mlOPN處理2h，分別提取細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞總蛋白，Western blot分別測定細(xì)胞核和細(xì)胞漿中NF-κB p65的表達(dá)水平，并測定細(xì)胞總蛋白中IκB-a和IKK-a的表達(dá)水平。免疫熒光技術(shù)檢測NF-κB p65的表達(dá)水平及分布情況。⑼應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞30min，再加入400ng/mlOPN處理24h，定量PCR和Western blot測定EMT相關(guān)標(biāo)記

10、物的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①定量PCR結(jié)果顯示NSCLC細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)水平明顯高于正常肺上皮細(xì)胞，ELISA結(jié)果顯示NSCLC細(xì)胞OPN蛋白分泌水平明顯高于正常肺上皮細(xì)胞。選擇基礎(chǔ)OPN分泌水平較低的A549和NCI-H358非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞用于后續(xù)OPN處理實驗。②定量PCR結(jié)果顯示OPN可明顯抑制A549和NCI-H358細(xì)胞SIRT1 mRNA的表達(dá)水平，同時明顯抑制E-鈣粘蛋白mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)。

11、在蛋白水平上，Western blot分析顯示OPN可明顯抑制細(xì)胞SIRT1和E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)，除此之外，OPN明顯提高了細(xì)胞acetyl NF-κB p65的表達(dá)水平(P＜0.05)，且不改變總NF-κB p65的表達(dá)水平。③定量PCR和Western blot結(jié)果均顯示感染LV-SIRT1的A549和NCI-H358細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯高于感染LV-NC的細(xì)胞(P＜0.05)。SIRT1表達(dá)水平在感染LV

12、-NC的細(xì)胞和空白對照細(xì)胞中的差別無統(tǒng)計學(xué)意義。④400 ng/ml OPN處理慢病毒感染后的A549和NCI-H358細(xì)胞，72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn):經(jīng)OPN處理的感染LV-NC的細(xì)胞呈現(xiàn)類似間質(zhì)成纖維細(xì)胞的梭形。然而，經(jīng)OPN處理的SIRT1過表達(dá)細(xì)胞與未加OPN處理的細(xì)胞相似，依然保持著上皮細(xì)胞的鵝卵石樣形態(tài)。⑤400 ng/ml OPN處理慢病毒感染后的A549和NCI-H358細(xì)胞，24h后定量PCR和Western blo

13、t分別測定EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平。結(jié)果顯示SIRT1過表達(dá)可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的上皮標(biāo)記物(E-鈣粘蛋白)mRNA和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，同時抑制OPN誘導(dǎo)的間質(zhì)標(biāo)記物(N-鈣粘蛋白和波形蛋白)表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)。同時，Western blot顯示單純SIRT1過表達(dá)細(xì)胞的acetyl NF-κB p65表達(dá)水平明顯低于空白對照組(P＜0.05)。OPN可明顯上調(diào)acetyl NF-κB p65的表達(dá)水平，而SIRT1過表達(dá)

14、可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的NF-κB p65乙酰化(P＜0.05)。⑥CCK-8實驗顯示OPN可促進(jìn)NSCLC增殖，而SIRT1過表達(dá)可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P＜0.05)。⑦400 ng/ml OPN處理慢病毒感染后的細(xì)胞48 h，劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:SIRT1過表達(dá)可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的A549和NCI-H358細(xì)胞遷移和侵襲(P＜0.05)。⑧400 ng/ml OPN處理慢病毒感染后的A549和NC

15、I-H358細(xì)胞2h，Western blot顯示OPN可明顯提高細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)，同時降低細(xì)胞漿中NF-κB p65表達(dá)，SIRT1過表達(dá)可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位（P＜0.05）。細(xì)胞免疫熒光的方法也得到了相同的結(jié)論。同時，Western blot顯示OPN可降低細(xì)胞IκB-a表達(dá)水平，提高IKK-a表達(dá)水平，SIRT1過表達(dá)可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的IκB-a表達(dá)下調(diào)以及IKK-a上調(diào)(P＜0.05)

16、。⑨NF-κB抑制劑PDTC可明顯抑制OPN誘導(dǎo)的E-鈣粘蛋白下調(diào)和N-鈣粘蛋白上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴OPN明顯抑制NSCLC細(xì)胞的SIRT1表達(dá)水平，促進(jìn)NF-κB p65乙?；＂芆PN通過抑制SIRT1表達(dá)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。⑶SIRT1過表達(dá)明顯抑制OPN誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。⑷SIRT1過表達(dá)通過抑制OPN誘導(dǎo)的NF-κB通路激活，進(jìn)而抑制OPN誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。