MiR-205調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:世界范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高,明確肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)的發(fā)病機(jī)制,對個(gè)體化治療極其重要。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)使腫瘤細(xì)胞獲得了侵襲轉(zhuǎn)移能力,構(gòu)成了腫瘤從原發(fā)灶轉(zhuǎn)移的第一步。有研究證實(shí)miR-205在乳腺癌中通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2的表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT過程的發(fā)

2、生。本研究擬探討:1.miR-205是否參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程;2.miR-205通過何種途徑調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程。
　　方法:(1)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用5ng/ml TGF-β1刺激非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,H226,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;然后提取這兩株細(xì)胞刺激前后的RNA和蛋白,運(yùn)用Real-time PCR、免疫組織化學(xué)、Western Blot方法檢測細(xì)胞中上皮標(biāo)記分子E-cadherin以及間充

3、質(zhì)標(biāo)記分子N-cadherin、Vimentin在RNA以及蛋白水平的表達(dá);(2)運(yùn)用Real-time PCR方法檢測A549和H226細(xì)胞在5ng/ml TGF-β1刺激前后miR-205、ZEB1、ZEB2的表達(dá);(3)在A549、H226細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-205mimics及陰性對照(negative control,NC),48h后應(yīng)用Real-time PCR方法檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimen

4、tin、ZEB1、ZEB2的表達(dá);(4)在A549、H226細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-205mimics及NC,48h后予以5ng/ml TGF-β1刺激,繼續(xù)培養(yǎng)48h后運(yùn)用Western Blot方法檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)5ng/ml TGF-β1刺激A549,H226細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)均呈梭形改變,且上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)明顯下降,而間充質(zhì)標(biāo)記分子N

5、-cadherin,Vimentin表達(dá)上升,提示兩株細(xì)胞均發(fā)生了EMT過程;(2)在A549和H226細(xì)胞中,miR-205在TGF-β1刺激后有不同程度下降;而轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2在TGF-β1刺激后均有顯著上升;(3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-205mimics及NC后,在A549細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上升、ZEB1、ZEB2表達(dá)下降,而N-cadherin、Vimentin的表達(dá)沒有顯著變化;在H226細(xì)胞中,E-cadhe

6、rin表達(dá)上升,N-cadherin、Vimentin、ZEB1、ZEB2表達(dá)均顯著下降。(4)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-205mimics及NC48h后,再次予以5ng/ml TGF-β1刺激48h,發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中,NC組中經(jīng)TGF-β1刺激后E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào),相對應(yīng)的mimics組中E-cadherin下調(diào)沒有NC組中明顯。而N-cadherin、Vimentin刺激前后的表達(dá)變化在兩組中沒有顯著差異。在H226細(xì)胞中,

7、NC組中經(jīng)TGF-β1刺激后N-cadherin、Vimentin的表達(dá)均有不同程度的上升,而mimics組則沒有顯著變化。
　　結(jié)論:我們的結(jié)果顯示5ng/ml TGF-β1可刺激肺癌細(xì)胞A549和H226發(fā)生EMT過程。在A549細(xì)胞中miR-205可能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2的表達(dá)來上調(diào)E-cadherin的表達(dá),從而抑制細(xì)胞EMT過程的發(fā)生;而在H226細(xì)胞中,異位表達(dá)的miR-205可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1