miR-181B-5p促進肺癌干細胞樣細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　目前，非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率約占全部肺部腫瘤發(fā)生率的80％-85％，是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的腫瘤疾病。盡管最近10年，我們在肺癌發(fā)生的分子生物學機制的研究方面取得了長足的進步，并采取了包括手術切除、傳統(tǒng)化療、放療、分子靶向治療及免疫治療等綜合治療手段，但是患者的5年生存率依然沒有明顯的改善，只有15.9％的肺癌患者能存活5年以上，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移。
　　目前學術界普遍接受腫瘤干細

2、胞假說:在惡性腫瘤組織中存在著具有干細胞樣特性的細胞亞群，即腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem-like cells，CSLCs)或稱腫瘤起始細胞(tumor initiating cells，TICs)，其不僅具有自我更新和多向分化的能力，而且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)及放化療抵抗密切相關。腫瘤干細胞樣細胞的存在已經(jīng)在造血系統(tǒng)腫瘤及肺癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)瘤等多種實體惡性腫瘤的研究中得到了證實。目前多通過無血清懸浮培養(yǎng)成球富集

3、技術或者利用細胞表面標志物進行流式細胞分選，對腫瘤干細胞樣細胞進行分離與鑒定。研究顯示，肺癌干細胞樣細胞的細胞表面標志物主要包括:CD133+、CD326+、CD44+、CD166+、ALDH1A1+、Sca1+/CD34+（小鼠），等。這些表面標志物單獨或者共表達在腫瘤細胞表面，作為腫瘤干細胞樣細胞的識別分子，為以腫瘤干細胞樣細胞為靶細胞的根治性研究提供了突破口。
　　上皮細胞間質(zhì)樣改變(EMT)是指細胞形態(tài)從上皮細胞向間質(zhì)細胞

4、表型轉(zhuǎn)化的過程。大量研究發(fā)現(xiàn)，EMT不僅參與胚胎發(fā)育、器官纖維化，并且在腫癟侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用。在腫瘤細胞發(fā)生EMT的過程中，原來在上皮細胞表面表達的標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達減少，反而間質(zhì)細胞表面標志物如波形蛋白(vimentin)、N型鈣粘蛋白(N-cadherin)等表達上調(diào)，細胞失去極性，細胞間的連接變得疏松，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組，細胞的運動能力增加，進而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。EMT的過程受Wnt、轉(zhuǎn)

5、化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Notch等多種信號通路的調(diào)節(jié)。近年來的研究表明，microRNAs(miRNAs)也參與腫瘤EMT過程。miRNAs是一類長約19～22個核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA。大量的研究證實，miRNAs通過誘導目的mRNA降解或抑制其翻譯蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控該基因表達，發(fā)揮著類似癌基因與抑癌基因的角色，顯示其作為腫瘤標志物、預后判斷、療效監(jiān)測

6、以及腫瘤靶向治療新靶點的廣闊應用前景。目前有研究表明，miRNAs也參與到腫瘤EMT過程中的各個環(huán)節(jié)，miR-200家族通過調(diào)控ZEB基因的表達在抑制腫瘤EMT過程中起重要作用;而miR-214通過PI3K/AKT通路可誘導卵巢癌細胞發(fā)生EMT。
　　MiRNAs在腫瘤干細胞樣細胞和腫瘤細胞的EMT過程中均發(fā)揮著重要作用，其復雜而龐大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡是目前研究的熱點，然而，其中仍有很多疑問亟待探討:如腫瘤干細胞樣細胞本身是否會發(fā)生EMT

7、?發(fā)生EMT的腫瘤干細胞樣細胞是否是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的根本原因？其過程是否受到miRNAs的調(diào)控？其機制如何，能否指導臨床實踐？本課題將圍繞上述問題展開研究。
　　研究目的：
　　1.誘導肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT。
　　2.篩選出肺腺癌干細胞發(fā)生EMT前后差異表達的miRNAs。
　　3.驗證差異表達的miRNA調(diào)控肺腺癌干細胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學行為變化并探討其具體機制。
　　研究方法：
　

8、　一、誘導肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT
　　1.對普通肺腺癌細胞A549進行無血清懸浮培養(yǎng)，誘導出富集成球的肺癌干細胞。
　　2.利用流式細胞分選(FACS)篩選出CD133+/CD326+細胞，并利用裸鼠成瘤、定量PCR檢測CD133、CD326、OCT-4和Nanog的表達和激光共聚焦技術(Confocallaser scanning microscope，CLSM)對其干性表達進行鑒定。
　　3.TGF-β1誘導

9、CD133+/CD326+細胞發(fā)生EMT，利用Transwell侵襲實驗和實時定量PCR技術從形態(tài)學和基因水平對其進行驗證。
　　二、利用miRNAs芯片檢測人肺腺癌干細胞樣細胞誘導發(fā)生EMT前后miRNAs的差異表達，篩選出有意義的miRNAs。
　　1.利用實時定量PCR miRNA芯片初步篩查檢測A549，A549+TGF-β1，CD133+/CD326+細胞和CD133+/CD326+細胞+TGF-β14組細胞，得到

10、差異miRNAs表達譜。
　　2.對差異miRNAs進行靶基因預測及功能分析，構建miRNA-gene-network調(diào)控網(wǎng)絡圖譜，篩選出有意義的目標miRNAs基因，并利用實時定量PCR技術對結(jié)果進行重新驗證。
　　三、驗證miR-181b-5p調(diào)控肺腺癌干細胞樣細胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學行為變化并探討其具體機制
　　1.miR-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir構建。 Agomir和an

11、tagomir轉(zhuǎn)染A549和CD133+/CD326+細胞，實時定量PCR檢測miR-181b-5p表達情況。
　　2.實時定量PCR及Western blot檢測E-cadherin表達。
　　3.Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲能力改變，裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實驗驗證agomir轉(zhuǎn)染后腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成能力。
　　4.比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功

12、建立肺腺癌干細胞樣細胞EMT模型
　　通過對普通A549細胞進行無血清懸浮培養(yǎng)，成功誘導出大量致密成球的肺腺癌干細胞樣細胞球，并利用流式細胞分選技術進一步篩選出CD133+/CD326+細胞。干性鑒定實驗證明CD133+/CD326+細胞具有干細胞特性，符合進一步實驗標準。利用TGF-對收集的CD133+/CD326+細胞進行EMT誘導，其形態(tài)發(fā)生了明顯的類間質(zhì)變化，且實時定量PCR檢測EMT相關基因發(fā)生明顯正向改變，Transw

13、ell侵襲實驗證實細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到提升。因此，我們確認已經(jīng)成功建立肺腺癌干細胞樣細胞EMT模型。
　　2.篩選出肺腺癌干細胞樣細胞EMT相關基因miR-181b-5p
　　利用實時定量PCR miRNA芯片對A549，A549+TGF-β1，CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β14組細胞進行組間miRNAs的差異表達，得到差異miRNAs表達譜。對差異miRNAs進行維恩圖分析，找到特異與

14、共有的差異miRNAs進行后續(xù)分析。通過Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫進行靶向基因預測并計算結(jié)合分值和結(jié)合位點。對靶基因根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫進行顯著性Pathway分析，找到miRNA靶基因所參與的信號轉(zhuǎn)導通路。以miRNAs與基因之間的關系，構建相互作用網(wǎng)絡，找到網(wǎng)絡中核心調(diào)控能力的miRNAs和受miRNAs調(diào)控影響最大的基因。利用實時定量PCR技術對篩選出來的miRNAs進行驗證，提示只有miR-181b-5p的表達趨勢

15、符合芯片數(shù)據(jù)和實驗設計，且miR-181b-5p在A549及腫瘤干細胞樣細胞誘導EMT過程中均高表達。因此，miR-181b-5p是下一步研究的目標分子。
　　3.miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達，促進肺腺癌干細胞樣細胞發(fā)生EMT并促進腫瘤轉(zhuǎn)移
　　構建miR-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir并轉(zhuǎn)染到A549和CD133+/CD326+細胞，實時定量PCR檢測miR-181b-

16、5p表達，結(jié)果顯示agomir和antagomir分別促進和抑制miR-181b-5p的表達。Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲能力改變，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染agomir后A549、A549+TGF-β1、CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1這4組細胞的侵襲能力均得到增強;而轉(zhuǎn)染antagomir后其侵襲能力得到不同程度的下降。說明miR-181b-5p表達量與細胞的侵襲能力成正相關。通過實時定量PCR技

17、術檢測轉(zhuǎn)染agomir和antagomir前后細胞的EMT相關基因表達情況，發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因的表達趨勢與miR-181b-5p表達量呈相反趨勢，miR-181b-5p過表達顯著抑制E-cadherin表達;Western blot檢測E-cadherin蛋白的表達情況進一步確認上述結(jié)論，提示E-cadherin基因可能是miR-181b-5p的下游靶基因。通過向裸鼠移植瘤定期注射agomir的方法，我們可以看到注射agomi

18、r后的裸鼠發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的情況明顯增多。進一步比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達情況，結(jié)果顯示腫瘤患者的外周血中miR-181b-5p表達普遍升高。
　　研究結(jié)論：
　　miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達，促進肺腺癌干細胞樣細胞EMT形成過程，增強了癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的形成，初步臨床實驗也顯示miR-181b-5p與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，并在腫瘤患者外周血中高表達。因此，