miR-181B-5p促進(jìn)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　目前，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率約占全部肺部腫瘤發(fā)生率的80％-85％，是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的腫瘤疾病。盡管最近10年，我們?cè)诜伟┌l(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制的研究方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，并采取了包括手術(shù)切除、傳統(tǒng)化療、放療、分子靶向治療及免疫治療等綜合治療手段，但是患者的5年生存率依然沒有明顯的改善，只有15.9％的肺癌患者能存活5年以上，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。
　　目前學(xué)術(shù)界普遍接受腫瘤干細(xì)

2、胞假說:在惡性腫瘤組織中存在著具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞亞群，即腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem-like cells，CSLCs)或稱腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells，TICs)，其不僅具有自我更新和多向分化的能力，而且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及放化療抵抗密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的存在已經(jīng)在造血系統(tǒng)腫瘤及肺癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)瘤等多種實(shí)體惡性腫瘤的研究中得到了證實(shí)。目前多通過無血清懸浮培養(yǎng)成球富集

3、技術(shù)或者利用細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞分選，對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行分離與鑒定。研究顯示，肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物主要包括:CD133+、CD326+、CD44+、CD166+、ALDH1A1+、Sca1+/CD34+（小鼠），等。這些表面標(biāo)志物單獨(dú)或者共表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，作為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的識(shí)別分子，為以腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞為靶細(xì)胞的根治性研究提供了突破口。
　　上皮細(xì)胞間質(zhì)樣改變(EMT)是指細(xì)胞形態(tài)從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞

4、表型轉(zhuǎn)化的過程。大量研究發(fā)現(xiàn)，EMT不僅參與胚胎發(fā)育、器官纖維化，并且在腫癟侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，原來在上皮細(xì)胞表面表達(dá)的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少，反而間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物如波形蛋白(vimentin)、N型鈣粘蛋白(N-cadherin)等表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間的連接變得疏松，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。EMT的過程受Wnt、轉(zhuǎn)

5、化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Notch等多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。近年來的研究表明，microRNAs(miRNAs)也參與腫瘤EMT過程。miRNAs是一類長(zhǎng)約19～22個(gè)核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA。大量的研究證實(shí)，miRNAs通過誘導(dǎo)目的mRNA降解或抑制其翻譯蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控該基因表達(dá)，發(fā)揮著類似癌基因與抑癌基因的角色，顯示其作為腫瘤標(biāo)志物、預(yù)后判斷、療效監(jiān)測(cè)

6、以及腫瘤靶向治療新靶點(diǎn)的廣闊應(yīng)用前景。目前有研究表明，miRNAs也參與到腫瘤EMT過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，miR-200家族通過調(diào)控ZEB基因的表達(dá)在抑制腫瘤EMT過程中起重要作用;而miR-214通過PI3K/AKT通路可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　MiRNAs在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EMT過程中均發(fā)揮著重要作用，其復(fù)雜而龐大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是目前研究的熱點(diǎn)，然而，其中仍有很多疑問亟待探討:如腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞本身是否會(huì)發(fā)生EMT

7、?發(fā)生EMT的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞是否是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的根本原因？其過程是否受到miRNAs的調(diào)控？其機(jī)制如何，能否指導(dǎo)臨床實(shí)踐？本課題將圍繞上述問題展開研究。
　　研究目的：
　　1.誘導(dǎo)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　2.篩選出肺腺癌干細(xì)胞發(fā)生EMT前后差異表達(dá)的miRNAs。
　　3.驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學(xué)行為變化并探討其具體機(jī)制。
　　研究方法：
　

8、　一、誘導(dǎo)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT
　　1.對(duì)普通肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)出富集成球的肺癌干細(xì)胞。
　　2.利用流式細(xì)胞分選(FACS)篩選出CD133+/CD326+細(xì)胞，并利用裸鼠成瘤、定量PCR檢測(cè)CD133、CD326、OCT-4和Nanog的表達(dá)和激光共聚焦技術(shù)(Confocallaser scanning microscope，CLSM)對(duì)其干性表達(dá)進(jìn)行鑒定。
　　3.TGF-β1誘導(dǎo)

9、CD133+/CD326+細(xì)胞發(fā)生EMT，利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)從形態(tài)學(xué)和基因水平對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。
　　二、利用miRNAs芯片檢測(cè)人肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生EMT前后miRNAs的差異表達(dá)，篩選出有意義的miRNAs。
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR miRNA芯片初步篩查檢測(cè)A549，A549+TGF-β1，CD133+/CD326+細(xì)胞和CD133+/CD326+細(xì)胞+TGF-β14組細(xì)胞，得到

10、差異miRNAs表達(dá)譜。
　　2.對(duì)差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及功能分析，構(gòu)建miRNA-gene-network調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜，篩選出有意義的目標(biāo)miRNAs基因，并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行重新驗(yàn)證。
　　三、驗(yàn)證miR-181b-5p調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT的體內(nèi)或體外的生物學(xué)行為變化并探討其具體機(jī)制
　　1.miR-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir構(gòu)建。 Agomir和an

11、tagomir轉(zhuǎn)染A549和CD133+/CD326+細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-181b-5p表達(dá)情況。
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)E-cadherin表達(dá)。
　　3.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力改變，裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證agomir轉(zhuǎn)染后腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成能力。
　　4.比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功

12、建立肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT模型
　　通過對(duì)普通A549細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出大量致密成球的肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞球，并利用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)一步篩選出CD133+/CD326+細(xì)胞。干性鑒定實(shí)驗(yàn)證明CD133+/CD326+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。利用TGF-對(duì)收集的CD133+/CD326+細(xì)胞進(jìn)行EMT誘導(dǎo)，其形態(tài)發(fā)生了明顯的類間質(zhì)變化，且實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因發(fā)生明顯正向改變，Transw

13、ell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到提升。因此，我們確認(rèn)已經(jīng)成功建立肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT模型。
　　2.篩選出肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT相關(guān)基因miR-181b-5p
　　利用實(shí)時(shí)定量PCR miRNA芯片對(duì)A549，A549+TGF-β1，CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β14組細(xì)胞進(jìn)行組間miRNAs的差異表達(dá)，得到差異miRNAs表達(dá)譜。對(duì)差異miRNAs進(jìn)行維恩圖分析，找到特異與

14、共有的差異miRNAs進(jìn)行后續(xù)分析。通過Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶向基因預(yù)測(cè)并計(jì)算結(jié)合分值和結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)靶基因根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行顯著性Pathway分析，找到miRNA靶基因所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。以miRNAs與基因之間的關(guān)系，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，找到網(wǎng)絡(luò)中核心調(diào)控能力的miRNAs和受miRNAs調(diào)控影響最大的基因。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)篩選出來的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，提示只有miR-181b-5p的表達(dá)趨勢(shì)

15、符合芯片數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，且miR-181b-5p在A549及腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)EMT過程中均高表達(dá)。因此，miR-181b-5p是下一步研究的目標(biāo)分子。
　　3.miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移
　　構(gòu)建miR-181b-5p模擬物agomir和抑制劑antagomir并轉(zhuǎn)染到A549和CD133+/CD326+細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-181b-

16、5p表達(dá)，結(jié)果顯示agomir和antagomir分別促進(jìn)和抑制miR-181b-5p的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力改變，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染agomir后A549、A549+TGF-β1、CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1這4組細(xì)胞的侵襲能力均得到增強(qiáng);而轉(zhuǎn)染antagomir后其侵襲能力得到不同程度的下降。說明miR-181b-5p表達(dá)量與細(xì)胞的侵襲能力成正相關(guān)。通過實(shí)時(shí)定量PCR技

17、術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染agomir和antagomir前后細(xì)胞的EMT相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因的表達(dá)趨勢(shì)與miR-181b-5p表達(dá)量呈相反趨勢(shì)，miR-181b-5p過表達(dá)顯著抑制E-cadherin表達(dá);Western blot檢測(cè)E-cadherin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)一步確認(rèn)上述結(jié)論，提示E-cadherin基因可能是miR-181b-5p的下游靶基因。通過向裸鼠移植瘤定期注射agomir的方法，我們可以看到注射agomi

18、r后的裸鼠發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的情況明顯增多。進(jìn)一步比較正常人與腫瘤患者外周血中的miR-181b-5p表達(dá)情況，結(jié)果顯示腫瘤患者的外周血中miR-181b-5p表達(dá)普遍升高。
　　研究結(jié)論：
　　miR-181b-5p通過下調(diào)E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞EMT形成過程，增強(qiáng)了癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的形成，初步臨床實(shí)驗(yàn)也顯示miR-181b-5p與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并在腫瘤患者外周血中高表達(dá)。因此，