miR-27B-5p促進(jìn)肝細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝癌是世界上最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，其療效差，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后不良，原因可能與腫瘤中存在的一小部分具有自我更新和多向分化能力的腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。miRNAs是一類單鏈非編碼RNA，其長約20-24個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)基因的作用。近年來，已經(jīng)證實(shí)miRNA在腫瘤干細(xì)胞及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，它們可能作為腫瘤潛在的分子治療靶點(diǎn)。在前期研究中，我們已經(jīng)利用miRNA芯片技術(shù)篩選出肝癌干樣細(xì)胞與肝

2、癌細(xì)胞中miRNAs的差異表達(dá)譜。接下來我們旨在從miRNAs的差異表達(dá)譜中找出與肝癌干樣細(xì)胞相關(guān)的miRNA，并研究其對肝癌細(xì)胞及肝癌干樣細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，為肝癌的診治提供新的方向。
　　方法:
　　第一部分:參與肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程miRNA的篩選及驗(yàn)證
　　1應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chainreaction，RT-PCR)方法在

3、Huh7肝癌細(xì)胞及肝癌干樣細(xì)胞中驗(yàn)證部分芯片結(jié)果。
　　2應(yīng)用RT-PCR方法在肝癌組織及癌旁肝組織中驗(yàn)證部分芯片結(jié)果。
　　第二部分:miR-27b-5p對肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的腫瘤生物學(xué)功能研究
　　1應(yīng)用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建miR-27b-5p過表達(dá)的肝癌細(xì)胞。
　　2應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)檢測miR-27b-5p在體外實(shí)驗(yàn)中對

4、肝癌細(xì)胞生物學(xué)的影響。
　　3應(yīng)用單細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)檢測miR-27b-5p在體外實(shí)驗(yàn)中對肝癌干樣細(xì)胞干性的影響。
　　第三部分:miR-27b-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　1通過DIANA、MICRORNA、MIRDB、PICTAR、TargetMiner、RNA22等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-27b-5p調(diào)控的下游靶基因。
　　2應(yīng)用定量RT-PCR方法檢測mi

5、R-27b-5p與靶基因在mRNA水平上的相關(guān)性。
　　3應(yīng)用Western Blot方法檢測miR-27b-5p與靶基因在蛋白水平上的相關(guān)性。
　　4應(yīng)用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-27b-5p對靶基因的直接調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:參與肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程miRNA的篩選及驗(yàn)證
　　1在前期研究中，通過miRNA芯片技術(shù)初步獲得肝癌干樣細(xì)胞與肝癌細(xì)胞miRNAs的差異表達(dá)譜，

6、對芯片結(jié)果進(jìn)行分析，肝癌干樣細(xì)胞與肝癌細(xì)胞相比，差異十倍以上的miRNA有35個，上調(diào)10個，下調(diào)25個，運(yùn)用定量RT-PCR方法檢測miR-27b-5p在Huh7肝癌細(xì)胞及肝癌干樣細(xì)胞中的表達(dá)與芯片結(jié)果一致。
　　2運(yùn)用定量RT-PCR方法檢測miR-27b-5p在肝癌組織及癌旁肝組織中的表達(dá)與芯片結(jié)果一致。
　　第二部分:miR-27b-5p對肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的腫瘤生物學(xué)功能研究
　　1 miR-27b-

7、5p過表達(dá)慢病毒感染Huh7肝癌細(xì)胞，感染72h后，miR-27b-5p組和對照慢病毒(NC)組均出現(xiàn)明顯綠色熒光蛋白表達(dá)，提示慢病毒感染成功。將感染后的肝癌細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)一步行定量RT-PCR檢測，miR-27b-5p組目的基因的表達(dá)明顯高于NC組和空白對照(Blank)組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明過表達(dá)miR-27b-5p成功。
　　2通過慢病毒載體在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-27b-5p成功后，進(jìn)行一系

8、列腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為檢測:CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)Huh7肝癌細(xì)胞的增殖（P＜0.05）;平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)Huh7肝癌細(xì)胞的克隆形成(P＜0.01);劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)Huh7肝癌細(xì)胞的遷移(P＜0.05);Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)Huh7肝癌細(xì)胞的侵襲(P＜0.01)。此外，對過表達(dá)miR-27b-5p

9、的腫瘤細(xì)胞在干性方面的變化進(jìn)行檢測:單細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)肝癌干樣細(xì)胞的自我更新（P＜0.01）。定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27b-5p可促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性基因的表達(dá)(P＜0.01)。
　　第三部分:miR-27b-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞向肝癌干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　1通過DIANA、MICRORNA等生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)FOXO1可能是miR-27b-5p的下游靶點(diǎn)。FOXO1已被證實(shí)

10、是哺乳動物細(xì)胞中重要的抑癌基因。
　　2定量RT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)miR-27b-5p肝癌細(xì)胞中的FOXO1mRNA表達(dá)水平相比于NC組和Blank組肝癌細(xì)胞明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　3 Western Blot結(jié)果顯示過表達(dá)miR-27b-5p肝癌細(xì)胞的FOXO1蛋白表達(dá)水平相比于NC組和Blank組肝癌細(xì)胞明顯降低，而NC組與Blank組之間無明顯差異。
　　4雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯

11、示相對于FOXO1-Mut組，miR-27b-5pmimics的作用后，F(xiàn)OXO1-WT組的FOXO1-3'UTR質(zhì)粒的表達(dá)趨勢降低。
　　結(jié)論:
　　1 miR-27b-5p不僅可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，而且可促進(jìn)肝癌干樣細(xì)胞的自我更新與肝癌細(xì)胞干性基因的表達(dá)。
　　2生物信息學(xué)軟件預(yù)測FOXO1可能是miR-27b-5p的下游靶點(diǎn)。
　　3 miR-27b-5p與FOXO1的表達(dá)具有顯著相關(guān)性，且通過