HSD17B4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究.pdf

1、為了探討HSD17B4是否在肝細(xì)胞癌中表達(dá)也增加？它是否通過降低E2的水平促進(jìn)了癌癥的發(fā)展進(jìn)程？HSD17B4滅活E2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與增殖相關(guān)基因的活化是否存在關(guān)聯(lián)？本實(shí)驗以HCC大鼠，HCC患者肝臟腫瘤和癌旁組織，以及HepG2細(xì)胞作為研究對象，進(jìn)行以下三部分研究:一、以肝癌模型大鼠和人肝癌的組織切片為實(shí)驗對象，觀察肝癌組織的HSD17B4表達(dá)，分析鼠肝HSD17B4的表達(dá)與炎癥和增殖相關(guān)性。二、在肝癌細(xì)胞HepG2和人肝癌的組織切

2、片中，驗證了HSD17B4是NF-κB下游靶基因，證實(shí)炎癥狀態(tài)下HSD17B4的表達(dá)上調(diào)，滅活了雌二醇而促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。三、HSD17B4通過滅活E2促HepG2細(xì)胞的增殖與信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription3，STAT3)的激活有關(guān)。本研究旨在為HCC的發(fā)生發(fā)展提供新的視角，為HSD17B4作為HCC防治新靶點(diǎn)的研究打下基礎(chǔ)。本文主要從

3、以下幾部分展開論述:
　　第一部分 大鼠肝癌組織中HSD17B4的表達(dá)與炎癥和增殖的相關(guān)性
　　目的:檢測HCC大鼠肝組織中HSD17B4表達(dá)和活性，以及炎性因子、增殖相關(guān)基因的表達(dá);并結(jié)合相關(guān)性分析評價HSD17B4與炎癥、增殖的關(guān)系。
　　方法:1.利用2-乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠肝癌模型。2.HE染色檢測肝臟損傷程度。3.Western blotting檢測p-Akt

4、、p-MEK、p-ERK以及HSD17B4的蛋白表達(dá)。4.免疫組化檢測HSD17B4在大鼠肝臟以及肝癌患者肝臟中的表達(dá)。5.Real-time PCR檢測HSD17B4，炎性因子IL-6、TNF-α，以及增殖基因cyclin D1、PCNA的mRNA表達(dá)。6.放射免疫分析檢測E2的改變。7.用spearman correlation test對HSD17B4與炎性因子、增殖基因進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠肝癌模

5、型成立。
　　2.HSD17B4在HCC組大鼠肝癌組織及人HCC肝癌組織中表達(dá)增加。
　　3.大鼠肝組織和血清中E2水平降低。
　　4.炎癥因子與HSD17B4的表達(dá)呈一定的線性正相關(guān)。
　　5.增殖相關(guān)基因與HSD17B4的表達(dá)呈一定的線性正相關(guān)。
　　小結(jié):
　　HCC大鼠肝癌組織中HSD17B4表達(dá)及活性顯著增加。HSD17B4的表達(dá)與炎癥因子和增殖相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)性。
　　第二部分

6、 NF-κB上調(diào)HSD17B4的表達(dá)進(jìn)而滅活雌二醇促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖
　　目的:以HepG2細(xì)胞為實(shí)驗對象，驗證HSD17B4與NF-κB，E2以及細(xì)胞增殖之間可能存在的聯(lián)系。另外，我們也以人肝癌組織為對象，證明HSD17B4與NF-κB的關(guān)系。
　　方法:1.利用CCK-8分析和BrdU摻入檢測HSD17B4的促增殖功能。2.Western blotting檢測增殖基因cyclin D1、PCNA表達(dá)，以及TNF-α

7、刺激對HSD17B4表達(dá)的影響。3.Real-time PCR檢測TNF-α刺激對HSD17B4和NF-κB的靶基因IL-6、IL-8轉(zhuǎn)錄水平的影響。4.報告基因分析和點(diǎn)突變實(shí)驗檢測激活的NF-κB通過作用于HSD17B4上游site A元件影響其轉(zhuǎn)錄激活。5.ChIP和Oligo pull down實(shí)驗驗證NF-κB與HSD17B4上游siteA元件特異性結(jié)合。6.放射免疫分析檢測E2的改變。7.免疫熒光檢測人肝癌與癌旁組織中HSD1

8、7B4表達(dá)的差異。8.用原位雜交聯(lián)合免疫熒光的方法，驗證人肝癌與癌旁組織中激活的NF-κB與HSD17B4上游的site A元件的結(jié)合的差異。
　　結(jié)果:
　　1.HSD17B4表達(dá)增加促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。
　　2.HepG2細(xì)胞中HSD17B4表達(dá)的增加伴隨著NF-κB的激活。
　　3.激活的NF-κB直接結(jié)合在HSD17B4上游NF-κB結(jié)合位點(diǎn)促進(jìn)HSD17B4的表達(dá)
　　報告基因分析結(jié)果顯示

9、，轉(zhuǎn)染site AB-wt質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶的激活在TNF-α誘導(dǎo)之后顯著增加，并且PDTC的預(yù)處理能夠有效抑制由TNF-α引起的增加。然而轉(zhuǎn)染site B-wt質(zhì)粒的細(xì)胞對刺激因素并沒有產(chǎn)生顯著地變化。位點(diǎn)突變試驗也同樣證明了site A對HSD17B4轉(zhuǎn)錄激活的重要性。說明存在于HSD17B4上游site A對于介導(dǎo)TNF-α引起的HSD17B4的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮了重要的作用。
　　ChIP實(shí)驗結(jié)果顯示，TNF-α處理可以顯著增加

10、site A與NF-κB p65的結(jié)合，而PDTC可以使此結(jié)合顯著降低;同樣條件下，NF-κB激活或抑制卻不能改變site B與NF-κB p65的結(jié)合。Oligo pull down進(jìn)一步證明了TNF-α激活NF-κB增加了NF-κB p65與site A探針結(jié)合的特異性。通過以上的實(shí)驗就進(jìn)一步說明，在HepG2細(xì)胞中由TNF-α誘導(dǎo)活化的NF-κB通過結(jié)合在HSD17B4上游的site A位點(diǎn)來促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　4.由活化

11、的NF-κB上調(diào)的HSD17B4表達(dá)降低了E2的水平。
　　5.HCC人肝癌組織中激活的NF-κB與HSD17B4上游site A位點(diǎn)結(jié)合增加，上調(diào)了HSD17B4的表達(dá)
　　免疫熒光的結(jié)果顯示，HSD17B4在HCC患者腫瘤組織的中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。原位雜交和免疫熒光相結(jié)合的實(shí)驗結(jié)果顯示，腫瘤組織中不僅活化的NF-κB入核增多，而且與HSD17B4上游區(qū)元件site A結(jié)合的量也明顯增加。說明HSD17B4的高表達(dá)，

12、是由活化的NF-κB結(jié)合在HSD17B4上游NF-κB結(jié)合元件所致。
　　小結(jié):
　　在肝癌細(xì)胞中HSD17B4是NF-κB的下游靶基因。TNF-α激活NF-κB促進(jìn)了HSD17B4的表達(dá)。HepG2細(xì)胞中HSD17B4通過滅活E2發(fā)揮促增殖的功能。
　　第三部分 過表達(dá)HSD17B4促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖與STAT3的激活有關(guān)
　　目的:檢測過表達(dá)或敲低HepG2細(xì)胞的HSD17B4對增殖相關(guān)信號途徑關(guān)鍵分子

13、以及STAT3的磷酸化的影響，進(jìn)一步證實(shí)HSD17B4促肝癌細(xì)胞增殖的作用
　　方法:1.免疫雙熒光共定位檢測HSD17B4的細(xì)胞定位。2.Westernblotting檢測p-STAT3、p-Akt、p-MEK和p-ERK的蛋白表達(dá)。3.免疫組化檢測HSD17B4和p-STAT3在HCC患者肝臟中的表達(dá)。4.用spearmancorrelation test對HSD17B4與p-STAT3免疫組化的灰度值進(jìn)行相關(guān)性分析。

14、　　結(jié)果:
　　1.過表達(dá)的HSD17B4定位于胞漿中
　　轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(Empty)中TRITC標(biāo)記的HSD17B4（綠色）與FITC標(biāo)記的PMP70（紅色）相互重合為黃色熒光，而同樣的條件下，RITC標(biāo)記的HSD17B4（綠色）與FITC標(biāo)記的GAPDH（紅色）不能相互重合為黃色熒光。證明靜息狀態(tài)下HSD17B4定位于過氧化物酶體。
　　轉(zhuǎn)染HSD17B4過表達(dá)質(zhì)粒或用TNF-α刺激細(xì)胞，過表達(dá)HSD17B4后，TR

15、ITC標(biāo)記的HSD17B4（綠色）與FITC標(biāo)記的PMP70（紅色）不能完全相互重合為黃色熒光。然而，TRITC標(biāo)記的HSD17B4（綠色）與FITC標(biāo)記的GAPDH（紅色）卻大部分相互重合為黃色熒光。說明過表達(dá)的HSD17B4多數(shù)定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　2.HSD17B4的過表達(dá)促進(jìn)了STAT3的激活
　　分別過表達(dá)和敲低HSD17B4，能相應(yīng)的顯著增強(qiáng)或減少STAT3的磷酸化水平，證明了HSD17B4對STAT3激活的正向

16、調(diào)節(jié)。通過對16例HCC患者肝癌組織樣本中，p-STAT3和HSD17B4的免疫組化結(jié)果的灰度值分析證實(shí)，p-STAT3與HSD17B4的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r2=0.6359，P＜0.01）。
　　3.HSD17B4的過表達(dá)促進(jìn)了Akt和MEK/ERK的磷酸化激活
　　通過對Akt，MEK，ERK，p38，JNK激酶活性的Western blotting檢測，過表達(dá)或敲低HSD17B4能使Akt，MEK和ERK的磷酸化水平顯

17、著增加或降低，但是p38和JNK的激酶活性并沒有改變。而當(dāng)我們用Akt的抑制劑LY294002和MEK/ERK的抑制劑PD98059預(yù)處理HSD17B4過表達(dá)的細(xì)胞，則有效地降低了由HSD17B4過表達(dá)引起的p-STAT3的表達(dá)水平。這就說明HSD17B4過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖與Akt和MEK/ERK激活促進(jìn)STAT3的活化有關(guān)。進(jìn)一步證明了HSD17B4具有促肝癌細(xì)胞增殖的作用。
　　小結(jié):
　　過表達(dá)的HSD17B4大部分