miR-21調(diào)控肝癌細胞增殖轉(zhuǎn)移分子機制的研究.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3、-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制基因表達。miRNAs在許多病理、生理過程中，包括癌癥發(fā)生及癌細胞轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色。miRNAs作為一類新型的調(diào)節(jié)因子，既可以作為原癌基因發(fā)揮作用，也可以作為抑癌基因調(diào)節(jié)細胞的生物學特性。miR-21作為一個典型的原癌基因，在腫瘤的的發(fā)生發(fā)展過程中同樣扮演令人矚目的角色，如肝癌中m

2、iR-21的異常表達能夠促進肝細胞癌的生長與轉(zhuǎn)移。作為 miR-21代表性的靶基因，癌細胞中 PTEN的失活導致了下游PI3K/AKT和 ERK信號通路的激活，從而增強了癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力；然而，在PTEN沉默的癌細胞中，miR-21表達的變化同樣引起了AKT/ERK信號通路活性的變化，這表明細胞中除了PTEN還存在其它機制調(diào)節(jié)AKT/ERK信號通路。hSulf-1是一種細胞膜上的肝素去硫酸酯酶，它能夠?qū)毎ど系牧蛩岣嗡氐鞍拙厶牵?/p>

3、HSPG）去硫酸化，從而阻斷肝素結(jié)合生長因子信號的傳導。通過調(diào)節(jié)肝癌細胞系中miR-21的表達，發(fā)現(xiàn)miR-21抑制PTEN表達的同時也能夠抑制hSulf-1的表達。因此，本研究旨在探索miR-21對hSulf-1及下游信號通路的影響，進一步研究miR-21對肝癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為肝癌的臨床基因治療提供新的靶點。
　　第一部分：肝癌細胞系miR-21的表達及其與成瘤能力的關(guān)系
　　【目的】檢測不同細胞系中miR-

4、21的表達，確定miR-21與肝癌細胞轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性。
　　【方法】應用熒光實時定量PCR檢測miR-21在不同轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系及正常細胞系中的表達水平；建立肝癌細胞小鼠體內(nèi)移植瘤模型，兩周后處死，并測量腫瘤形成情況，比較不同轉(zhuǎn)移性肝癌細胞的瘤形成能力，確定miR-21表達水平與肝癌細胞轉(zhuǎn)移性能之間的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】熒光實時定量PCR表明，miR-21在肝癌細胞系MHCC-97H（MHCC-97H:6.73±1.01

5、）中表達高于MHCC-97L、SMMC-7721（MHCC-97L:4.35±0.53,SMMC-7721:1.10±0.13）中表達；動物成瘤實驗表明高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞MHCC-97H比SMMC-7721細胞形成更多更大的瘤塊。
　　【結(jié)論】miR-21在高轉(zhuǎn)移性的癌細胞中高表達，miR-21的高表達與癌細胞的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
　　第二部分：miR-21對肝癌細胞侵襲、遷移、增殖及成瘤能力的影響
　　【目的】研究miR-

6、21對肝癌細胞侵襲、遷移、增殖及成瘤能力的影響。
　　【方法】采用劃痕實驗、Transwell實驗檢測miR-21對肝癌細胞侵襲、遷移的影響；應用MTT實驗、細胞軟瓊脂克隆形成實驗研究miR-21對肝癌細胞增殖、成瘤能力的影響。
　　【結(jié)果】劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果表明，與實驗對照組相比，miR-21過表達載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞促進了細胞的侵襲及遷移能力，miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染MHCC-97H細胞抑制了細

7、胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；細胞增殖實驗結(jié)果表明，SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-21過表達載體后促進了細胞的增殖，MHCC-97H轉(zhuǎn)染miR-21拮抗劑后減弱了細胞的增殖能力；細胞軟瓊脂克隆形成實驗表明，miR-21過表達載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞增強了細胞的成瘤能力，MHCC-97H中轉(zhuǎn)染miR-21拮抗劑減弱了MHCC-97H細胞的腫瘤形成能力。
　　【結(jié)論】miR-21能夠調(diào)節(jié)肝癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及成瘤能力。
　　第

8、三部分：miR-21調(diào)節(jié)肝癌細胞侵襲、遷移、增殖的分子機制
　　【目的】研究miR-21調(diào)節(jié)肝癌細胞侵襲、遷移、增殖可能的分子機制。
　　【方法】miR-21過表達載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染MHCC-97H細胞，熒光實時定量PCR檢測處理后SMMC-7721和MHCC-97H中miR-21的表達；蛋白免疫印跡法檢測SMMC-7721和MHCC-97H中EMT標志物及PTEN、hSulf-1信號通路

9、的變化。
　　【結(jié)果】熒光實時定量PCR實驗顯示，SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-21過表達載體后miR-21表達上調(diào)，MHCC-97H轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后miR-21表達下調(diào)；蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，miR-21過表達導致上皮標志物E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)標志物β-catenin、vimentin上調(diào)，與此同時，伴隨著PTEN、hSulf-1的下調(diào)，p-AKT、p-ERK的表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。相反的，MHCC-97H細胞