ANXA3調(diào)控小鼠肝癌細(xì)胞惡性表型分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，有36 kDa和33 kDa兩種亞型，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細(xì)胞遺傳背景相似但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同，ANXA3在Hca-F和Hca-P細(xì)胞株中均高豐度表達(dá)但又有差異，是研究ANXA3與肝癌腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的理想模型。
　　目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-

2、shRNA-Anxa3表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F和Hca-P細(xì)胞，篩選ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的Hca-F和Hca-P單克隆細(xì)胞株;2、構(gòu)建pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并在Hca-P細(xì)胞中過表達(dá)ANXA3;3、考察ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-F細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲的影響;4、考察ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移、侵襲及耐藥性的影響;5、研究ANXA3

3、的亞細(xì)胞定位;6、考察ANXA3過表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響;7、系統(tǒng)研究ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細(xì)胞惡性表型的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法:1、利用在線軟件設(shè)計(jì)Anxa3基因的shRNA及無關(guān)序列(NC，陰性對(duì)照)，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3及pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC表達(dá)載體;2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A

4、nxa3/NC表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至Hca-F和Hca-P細(xì)胞，G418抗性篩選及有限稀釋法獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株，計(jì)算ANXA3下調(diào)效率;3、自行設(shè)計(jì)引物，利用基因工程方法構(gòu)建pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hca-P細(xì)胞;4、CCK-8法分析ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-F和Hca-P細(xì)胞，ANXA3過表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞增殖能力的影響;軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)考察ANXA3下調(diào)

5、及過表達(dá)對(duì)Hca-P細(xì)胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室法分析ANXA3的表達(dá)對(duì)Hca-F和Hca-P細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;6、CCK-8結(jié)合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA3下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞耐藥性及抗順鉑誘導(dǎo)凋亡的影響;7、激光掃描共聚焦實(shí)驗(yàn)確定ANXA3蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位;8、Western Blot確定ANXA3調(diào)控Hca-F和Hca-P細(xì)胞惡性行為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子水平變化。
　　結(jié)果

6、:1、成功構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3/NC表達(dá)載體，獲得ANXA3穩(wěn)定下調(diào)的F-ANXA3-shRNA、P-ANXA3-shRNA1和P-ANXA3-shRNA2單克隆細(xì)胞株;2、酶切及測序結(jié)果表明，pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達(dá)載體構(gòu)建成功;3、F-ANXA3-shRNA細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力分別是陰性對(duì)照組的1.62、1.59和2.98倍，ANX

7、A3下調(diào)通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路增強(qiáng)Hca-F細(xì)胞的惡性表型;4、P-ANXA3-shRNA1(2)細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別是陰性對(duì)照組的1.13(1.08)、4.06(4.86)、4.98(4.75)和2(2.77)倍，ANXA3下調(diào)通過激活Erk和JNK通路增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞的惡性表型;5、ANXA3過表達(dá)后，陰性對(duì)照組細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別提升為上調(diào)組的1.19、1.32、2

8、.92和3.4倍，ANXA3的過表達(dá)通過抑制Erk和JNK通路來抑制Hca-P細(xì)胞的惡性表型;6、激光掃描共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA3蛋白表達(dá)主要集中于細(xì)胞質(zhì)中;7、ANXA3下調(diào)增強(qiáng)了Hca-P細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，對(duì)5-FU耐藥性無明顯影響，ANXA3通過內(nèi)源性凋亡途徑調(diào)控Hca-P細(xì)胞的cisplatin的耐藥性。
　　結(jié)論:1、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3/NC、pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA

9、3.1/V5-HisB-Anxa3真核表達(dá)載體成功構(gòu)建;2、獲得了ANXA3表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株;3、ANXA3的下調(diào)通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路促進(jìn)Hca-F細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲惡性表型;4、ANXA3的下調(diào)增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，相反，ANXA3的過表達(dá)抑制Hca-P細(xì)胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，主要通過調(diào)控Erk和JNK通路來實(shí)現(xiàn);5、ANXA3蛋白表達(dá)主要集中于細(xì)胞