miR-630增強宮頸癌細胞惡性表型的作用與機制研究.pdf

1、宮頸癌是最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖器官惡性腫瘤總數(shù)的半數(shù)以上。放射治療是宮頸癌的主要治療方法之一。但臨床資料顯示，宮頸癌的放療效果仍然有限。研究發(fā)現(xiàn)，輻射抗性癌細胞的存在是宮頸癌患者放療后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。因此，明確調(diào)控宮頸癌輻射抵抗的關(guān)鍵分子和調(diào)控途徑，對于提高宮頸癌放療效果意義重大。多種信號通路，如NF-κB、PI3-K/Akt及TGFβ等通路，及多種關(guān)鍵分子，如HIF-1、p53、p21等，已被報道參與了宮頸癌細胞的

2、輻射敏感性的調(diào)控。宮頸癌輻射敏感性調(diào)節(jié)機制是涉及多因素、多步驟的復雜生物學過程，目前的研究尚未完全闡明，故有待于進一步研究。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有非常重要的作用，它被認為是腫瘤細胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵機制之一。EMT可使腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強。因此，深入研究腫瘤發(fā)生EMT的分子機制及相關(guān)重要調(diào)控因子，并對關(guān)鍵通路的關(guān)鍵分子進行干預，

3、理論上可以有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　microRNAs（miRNAs）是一類新的調(diào)控因子，參與調(diào)控眾多生物學過程，在機體的生長發(fā)育、疾病發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調(diào)控宮頸癌的輻射抗性及侵襲轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。本文從miRNA角度探尋宮頸癌輻射抵抗及侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機制，以期尋找關(guān)鍵作用的miRNA分子，將其作為潛在治療靶點，從而提高放療療效。
　　研究目的：
　　1.建立輻射抗性

4、宮頸癌細胞株并篩選抗性細胞中差異表達的miRNAs。
　　2.驗證miR-630對宮頸癌Hela細胞輻射抗性的調(diào)控作用。
　　3.研究miR-630對宮頸癌Hela細胞EMT的影響。
　　研究方法：
　　1.模擬臨床腫瘤放射治療的分割療法，2Gyγ射線連續(xù)照射宮頸癌Hela、Siha細胞建立輻射抗性宮頸癌細胞株。miRNA芯片技術(shù)篩選輻射抗性細胞與親本細胞中差異表達的miRNAs。
　　2.人宮頸癌Hela

5、細胞分別經(jīng)不同劑量的Co60γ射線照射，借助qRT-PCR檢測輻照后Hela細胞中miR-630的表達水平。Hela細胞經(jīng)6Gyγ射線照射后不同時間點，采用qRT-PCR檢測miR-630的表達水平。
　　3.制備miR-630的慢病毒表達載體，包括上調(diào)miR-630的載體Lentivirus-hsa-miR-630，下調(diào)miR-630的載體Lentivirus-hsa-miR-630-inhibition，以及空載體Lentiv

6、irus-negative control，并感染Hela細胞，利用Puromycin進行穩(wěn)定感染細胞篩選。通過qRT-PCR鑒定調(diào)變miR-630表達的Hela細胞株。
　　4.以調(diào)變miR-630表達的Hela細胞作為研究模型，采用6Gy和8Gyγ射線照射，借助MTT法檢測輻照后3、5、7天的細胞活性；利用克隆形成實驗觀察細胞輻照后的細胞克隆形成能力；采用流式細胞術(shù)檢測自發(fā)凋亡及輻射誘導的細胞凋亡；并利用Western Blo

7、t檢測細胞輻照前后凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2，Caspase3，Caspase7及Caspase9的表達水平。
　　5.移植瘤實驗觀察調(diào)變miR-630表達的Hela細胞株的致瘤性。
　　6.借助劃痕實驗，RTCA細胞遷移實驗和Transwell侵襲實驗，來觀察miR-630調(diào)變對宮頸癌Hela細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，采用Western Blot實驗檢測EMT相關(guān)標志物E-cadherin、Cytokeratin及N-

8、cadherin在miR-630調(diào)變表達的Hela細胞株中的表達。
　　7.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-630的靶基因。
　　8.不同乏氧條件處理宮頸癌Hela細胞后通過qRT-PCR檢測細胞中miR-630的表達水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1.成功建立輻射抗性宮頸癌細胞株Hela-R11及Siha-R15，在輻射抗性細胞中miR-630表達顯著上調(diào)。
　　2.輻射可誘導宮頸癌Hela細胞中miR-6

9、30表達上調(diào)，并具有劑量和時間依賴性。
　　3.成功建立穩(wěn)定調(diào)變miR-630的宮頸癌Hela細胞株。
　　4.miR-630可增強輻射后宮頸癌Hela細胞的活性及克隆形成能力，降低細胞的自發(fā)凋亡及輻射誘導的細胞凋亡，miR-630亦可增強抗凋亡蛋白Bcl-2表達，同時抑制促凋亡蛋白Bax,Caspase3,Caspase7 and Caspase9表達。
　　5.miR-630可增強宮頸癌Hela細胞的致瘤性。

10、>　　6.miR-630可增強Hela細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，同時通過降低上皮標志物E-cadherin和Cytokeratin的表達、升高間質(zhì)標志物N-cadherin的表達來誘導EMT發(fā)生。
　　7.miR-630對ZNF-451和IGF1R基因無直接調(diào)控作用。
　　8.乏氧可快速誘導Hela細胞中miR-630表達上調(diào)，并長時間維持miR-630的高表達水平。
　　結(jié)論：
　　輻射和乏氧可誘導miR-630在宮頸