miR-218與宮頸癌惡性程度的相關(guān)性及其作用機(jī)制的初步探究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第二位，僅次于乳腺癌，每年約有超過(guò)50萬(wàn)新發(fā)病例。2007年有25萬(wàn)人因此喪生，其中80％的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)每年約有新發(fā)病例13.15萬(wàn)，占世界新發(fā)病例的30％。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病年齡趨向年輕化，成為嚴(yán)重威脅中青年婦女健康的重大婦科腫瘤之一。
　　 通過(guò)大量的臨床、分子生物學(xué)及流行病學(xué)研究，人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)已被

2、證實(shí)是引起宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的主要病因。女性中HPV感染非常普遍，多數(shù)可自然清除，僅少數(shù)持續(xù)性感染，并可發(fā)展為CIN，最終進(jìn)展為浸潤(rùn)性宮頸癌。宮頸癌主要的病理類(lèi)型有宮頸鱗癌和腺癌，HPV16與宮頸鱗癌有關(guān)，HPV18與宮頸腺癌有關(guān)，但宮頸癌發(fā)生的具體分子機(jī)制尚不明確。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶基因降解或抑制

3、其翻譯，從而在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA參與了動(dòng)植物許多復(fù)雜的生命過(guò)程，包括發(fā)育、器官形成、凋亡和細(xì)胞增殖等。研究表明，miRNAs表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，miRNAs很可能是一類(lèi)潛在的癌基因或抑癌基因。最近有研究(1)發(fā)現(xiàn)HPV16陽(yáng)性的細(xì)胞系、宮頸損傷和宮頸癌組織與正常宮頸組織、HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系相比，miR-218的表達(dá)存在差異，提示miR-218的表達(dá)失衡可能參與了宮頸癌的發(fā)病過(guò)程。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)m

4、iR-218與宮頸癌惡性程度相關(guān)性的報(bào)道，而且文獻(xiàn)報(bào)道的miR-218在宮頸癌中的表達(dá)只檢測(cè)了HPV16陽(yáng)性細(xì)胞株和少數(shù)幾例宮頸癌標(biāo)本，并且這種檢測(cè)只是局限于組織中。而血清作為生物檢測(cè)樣本，具有取材方便，無(wú)創(chuàng)傷性，可連續(xù)體外檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，且血清miRNA的高度穩(wěn)定性也使得病人的實(shí)際值與實(shí)驗(yàn)的測(cè)試值相當(dāng)吻合。因此有必要深入開(kāi)展miR-218在宮頸癌中的表達(dá)和功能研究，以及對(duì)血清中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，為深入研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)理、早期診斷和治療提供

5、一種新的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 基于此，本課題的研究?jī)?nèi)容包括以下兩部分：
　　 第一部分:miR-218的表達(dá)水平與宮頸癌惡性程度的相關(guān)性
　　 背景和目的：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在15種致癌性HPV病毒中，HPV16最為常見(jiàn)，HPV16陽(yáng)性宮頸癌在所有宮頸癌中所占比例超過(guò)了50％。與正常宮頸組織、HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系相比，HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系、宮頸損傷和宮頸癌組織中miR-218

6、特異性低表達(dá)。在本研究中，我們檢測(cè)了正常宮頸組織、宮頸癌細(xì)胞系、癌前病變和宮頸癌中miR-218的表達(dá)狀況，檢測(cè)了宮頸癌患者血清中miR-218的表達(dá)水平，旨在探討miR-218的降低程度與感染的HPV型別、宮頸癌惡性程度的關(guān)系，探討宮頸癌組織和血清中miR-218表達(dá)水平的相關(guān)性，以及探討血清中miR-218的表達(dá)水平能否反映宮頸癌的惡性程度，為以后的早期診斷提供一種實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：本研究收集了22例子宮肌瘤患者

7、的正常宮頸組織作為對(duì)照組，收集了78例宮頸癌患者手術(shù)標(biāo)本、22例石蠟包埋標(biāo)本和18例宮頸癌患者的血清標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)了miR-218在正常宮頸組織、宮頸癌細(xì)胞系、癌前病變和宮頸癌中的表達(dá)，采用導(dǎo)流雜交法檢測(cè)了感染的HPV的型別，探討了miR-218的表達(dá)水平與HPV型別、宮頸癌惡性程度的相關(guān)性。對(duì)于收集到的部分宮頸癌患者的血清標(biāo)本，我們分離得到了小分子RNA，檢測(cè)了miR-218的表達(dá)，使用Pearson's相關(guān)系數(shù)描述了組織和血清

8、中miR-218表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們成功建立了檢測(cè)miR-218表達(dá)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法(UPL法)，確定了其檢測(cè)的線性范圍。
　　 2.驗(yàn)證了HPV16陽(yáng)性細(xì)胞系SiHa中miR-218的低表達(dá)。檢測(cè)到在HPV18陽(yáng)性的細(xì)胞系HeLa中，miR-218也呈低水平表達(dá)。
　　 3.高危型HPV感染的組織標(biāo)本中miR-218表達(dá)低于低危型組織標(biāo)本和對(duì)照組標(biāo)本，低危型感染組與

9、對(duì)照組中miR-218表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.在正常組織、CIN和宮頸癌中，miR-218由高到低依次是：正常組織>CINI>CINⅡ～Ⅲ>宮頸癌；而且，miR-218在宮頸癌患者血清中也呈低水平表達(dá)，與組織中的低表達(dá)存在相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.HPV18(+)的宮頸癌細(xì)胞系HeLa中miR-218呈低水平表達(dá)。
　　 2.宮頸癌和癌前病變中，高危型HPV感染組織中miR-218

10、呈低水平表達(dá)。
　　 3.隨著宮頸癌惡性程度的升高，miR-218的表達(dá)水平呈進(jìn)行性降低，這種降低可以反映在血清中。
　　 第二部分:miR-218在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中作用的初步探討
　　 背景和目的：miR-218與宮頸癌的惡性程度密切相關(guān)，但在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中所起的作用尚不清楚。本研究在體外人為改變宮頸癌細(xì)胞株中miR-218的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，并初步探討其影響機(jī)制。
　　 材料和方法

11、：在脂質(zhì)體siPORT NeoFX的介導(dǎo)下，將Pre-miR miRNA Precursor、Anti-miR miRNA Inhibitors以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染入C-33a、SiHa和HeLa細(xì)胞株中，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)miR-218表達(dá)水平的改變，用MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)各組細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響，用RT-PCR方法檢測(cè)了PI3K調(diào)節(jié)亞單位p85 mRNA的表達(dá)，并用Western blotting檢測(cè)了轉(zhuǎn)染前后p

12、85，Akt及p-Akt的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們成功地將miR-218轉(zhuǎn)染入SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，miR-218水平改變最為顯著，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸趨向正常水平。
　　 2.在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)，miR-218水平升高可促進(jìn)SiHa、HeLa細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；miR-218水平降低可抑制SiHa、HeLa的增殖，對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)傾向，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染后的48，72小時(shí)，這種促進(jìn)或抑

13、制作用消失。miR-218表達(dá)水平的改變對(duì)SiHa、HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期均無(wú)影響。對(duì)于C-33a，miR-218的表達(dá)水平改變對(duì)其增殖、凋亡和細(xì)胞周期均無(wú)影響。
　　 3.miR-218水平升高可促進(jìn)PI3K調(diào)節(jié)亞單位p85a蛋白的表達(dá)和下游效應(yīng)蛋白Akt的磷酸化，反之抑制p85蛋白的表達(dá)和Akt的磷酸化，對(duì)p85αmRNA的表達(dá)無(wú)影響。
　　 結(jié)論：雖然miR-218隨著宮頸癌惡性程度的升高而表達(dá)降低，但是體外實(shí)驗(yàn)表

14、明升高miR-218的表達(dá)水平對(duì)腫瘤細(xì)胞系SiHa、HeLa的生長(zhǎng)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，降低miR-218的表達(dá)對(duì)SiHa、HeLa的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，而且只有當(dāng)miR-218處于高濃度時(shí)才表現(xiàn)出這些作用，這說(shuō)明miR-218對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的復(fù)雜性，需要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)才能充分體現(xiàn)出它的作用。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.本研究證實(shí)了miR-218的表達(dá)水平與感染的HPV型別、宮頸癌惡性程度密切相關(guān)，而且這種相關(guān)性可