宮頸癌中TLR8的表達(dá)及其作用的初步研究.pdf

1、目的:
　　 為了研究腫瘤細(xì)胞TLR8的表達(dá)水平及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,考察了13種人腫瘤細(xì)胞系TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄的差異；選擇TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄較高的Hela細(xì)胞,探討TLR8激動(dòng)劑CL075對(duì)其生物學(xué)特性的影響；以人宮頸癌患者為研究對(duì)象,檢測(cè)宮頸癌患者癌組織TLR7、TLR8、TLR9及Bcl-2、VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄情況,分析TLR8,TLR7和Bcl-2,VEGFmRNA水平的相關(guān)性,為進(jìn)一步研究宮頸癌的發(fā)生

2、機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)采用PCR方法,以含有TLR8基因的pcDNA3.1-TLR8質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增TLR8基因,將擴(kuò)增得到的TLR8基因克隆至pMD18-T載體,實(shí)時(shí)定量檢測(cè)13種人腫瘤細(xì)胞系TLR8基因的表達(dá),以篩選TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄較高的腫瘤細(xì)胞系。
　　 (2)免疫熒光法檢測(cè)Hela細(xì)胞TLR8的表達(dá)。
　　 (3)應(yīng)用TLR8激動(dòng)劑CL075按0.5μg

3、／ml、1μg／ml、2μg／ml和2.5μg／ml的濃度分別加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)體系,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡的變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化,同時(shí)應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)CL075刺激后COX-2、Bcl-2、VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 (4)無(wú)菌收集江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科15例宮頸癌患者組織標(biāo)本,10例健康志愿者宮頸組織標(biāo)本。
　　 (5)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測(cè)人宮頸癌組

4、織TLR7、TLR8、TLR9及Bcl-2、VEGF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；應(yīng)用直線回歸法分析宮頸癌患者癌組織TLR8／7與Bcl-2、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 (1)構(gòu)建pMD18-T-TLR8質(zhì)粒,將擴(kuò)增得到的TLR8基因克隆至pMD18-T載體,經(jīng)序列測(cè)定顯示,與GenBank中人TLR8基因序列完全一致。研究表明Hela細(xì)胞系TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　 (2)免疫熒光定位

5、檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Hela細(xì)胞表達(dá)的TLR8定位于胞漿內(nèi)。
　　 (3)經(jīng)1μg／ml CL075刺激后Hela細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng),處在G2／M和S期的細(xì)胞比例增加。此外,宮頸癌Hela細(xì)胞COX-2、Bcl-2、VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平,在CL075刺激的48h內(nèi)呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄明顯增高的趨勢(shì)。
　　 (4)QRT-PCR分析結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組比較,宮頸癌患者癌組織TLR7和TLR8 mRNA的轉(zhuǎn)錄高于健康對(duì)照組,而TLR9

6、 mRNA的轉(zhuǎn)錄同健康對(duì)照組并沒有顯著差異,并且宮頸癌患者癌組織TLR8mRNA與Bcl-2、VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄有一定的相關(guān)性,而TLR7mRNA與Bcl-2、VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄并無(wú)相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 (1)人宮頸癌Hela細(xì)胞系表達(dá)TLR8。
　　 (2)TLR8激動(dòng)劑CL075作用于人宮頸癌Hela后,可促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖。
　　 (3)宮頸癌患者癌組織TLR7和TLR8 mRN