宮頸癌TSLP來源及其在營造癌灶微環(huán)境中的作用.pdf

1、宮頸癌，是一種婦科常見的惡性腫瘤，嚴重威脅婦女健康。但是至今為止，宮頸癌發(fā)病機制仍不完全清楚。近年，腫瘤微環(huán)境的研究引起廣泛高度重視，成為腫瘤生物學(xué)研究熱點。腫瘤局部微環(huán)境中的血管生成和免疫細胞對宮頸癌進展發(fā)揮著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。
　　TSLP是一種造血細胞因子，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)，此外在過敏性皮膚病、呼吸道疾病、寄生蟲感染和調(diào)節(jié)腸道免疫中具有重要作用。我們課題組前期工作發(fā)現(xiàn)人早孕期滋養(yǎng)細胞分泌的

2、TSLP可以以劑量依賴的方式促進滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲力，并誘導(dǎo)母-胎界面Th2免疫優(yōu)勢。母-胎界面滋養(yǎng)細胞具有獨特的類似于腫瘤細胞的生物學(xué)行為，即高增殖和侵襲能力。因此我們推測宮頸癌細胞可能通過分泌TSLP，以自分泌和旁分泌作用參與營造宮頸癌微環(huán)境。闡明TSLP在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用將有助于闡明宮頸癌發(fā)病機制。
　　本研究在前期工作基礎(chǔ)上，探討宮頸癌細胞是否通過分泌TSLP調(diào)節(jié)自身生長;進一步闡明宮頸癌細胞分泌的TSLP對癌

3、灶新生血管形成的調(diào)節(jié)作用，及其對癌灶浸潤的嗜酸性粒細胞功能的作用機制。
　　第一部分 TSLP對宮頸癌細胞活力的自分泌調(diào)節(jié)作用
　　目的：分析TSLP在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞生長的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集人宮頸炎和宮頸癌組織，免疫組化分析各組TSLP的表達;ELISA檢測宮頸癌細胞株（HeLa和CaSki細胞）不同時間點分泌的TSLP濃度;流式細胞術(shù)分析HeLa和CaSki細胞表面TSLP受體的表達水平;MT

4、T法分析不同濃度重組人TSLP對HeLa和CaSki細胞活力的調(diào)節(jié)作用;流式細胞術(shù)研究TSLP對HeLa和CaSki細胞增殖相關(guān)分子Ki-67表達的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：與宮頸炎相比，宮頸癌組織高表達TSLP;宮頸癌細胞株Caski和Hela細胞均分泌TSLP，并呈現(xiàn)時間依賴性。此外，兩種細胞均表達TSLPR，Caski細胞表達TSLPR水平高于Hela細胞;TSLP處理CaSki和HeLa細胞48或72h后，能顯著增強其細胞活力

5、;重組人TSLP(rhTSLP)均能促進CaSki和HeLa細胞表達Ki-67;抗人TSLP或TSLPR的中和性抗體下調(diào)Ki-67的表達。宮頸癌細胞通過分泌TSLP，以自分泌方式促進Ki-67表達，進而促進自身增殖，有利于腫瘤的生長和進展。
　　結(jié)論：宮頸癌細胞可表達TSLP，以自分泌方式上調(diào)Ki-67表達，進而促進自身增殖，有利于腫瘤的生長和進展。
　　第二部分宮頸癌細胞來源的TSLP在新生血管形成中的調(diào)節(jié)作用
　　

6、目的：解析TSLP對血管內(nèi)皮細胞的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)機制。
　　方法：收集人宮頸炎和宮頸癌組織，經(jīng)胰酶消化后獲得組織細胞懸液，流式細胞術(shù)分析各組血管內(nèi)皮細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVECs)表面TSLPR的表達水平;然后分別用不同濃度人rhTSLP處理HUVECs，或者加入HeLa或CaSki細胞培養(yǎng)上清，同時加入抗人TSLP或TSLPR中和性抗體，然后應(yīng)用BrdU增殖實驗、Annexin V-FITC/PI雙染法和成管實驗分別檢

7、測各組HUVECs的增殖、凋亡和成管能力;ELISA法檢測各組HUVECs分泌的IL-6、IL-8和VEGF水平;流式細胞術(shù)分析HUVECs細胞活化相關(guān)分子的表達水平。
　　結(jié)果：宮頸癌組織中，TSLP(+)的血管內(nèi)皮細胞比例為20.12％，明顯高于宮頸炎組織中的比例5.37％;重組人TSLP處理72h后，可刺激HUVECs增殖。阻斷TSLP或TSLPR可顯著抑制HeLa和CaSki細胞培養(yǎng)上清對HUVECs細胞增殖的促進效應(yīng);r

8、hTSLP上調(diào)HUVECs表達Ki-67，阻斷TSLP或TSLPR可顯著降低與HeLa或CaSki細胞共培養(yǎng)的HUVECs表達Ki-67; TSLP對HUVECs表面凋亡相關(guān)分子（Fas和FasL）的表達無明顯調(diào)節(jié)作用;rhTSLP顯著增加CD105的表達，但不改變CD62E的表達;然而阻斷TSLP和TSLPR均可降調(diào)與HeLa或CaSki細胞共培養(yǎng)后的HUVECs細胞CD105和CD62E的表達水平;rhTSLP增加HUVECs生成I

9、L-6，而阻斷TSLP或TSLPR可減少HeLa細胞分泌IL-6、IL-8和VEGF，并下調(diào)CaSki細胞分泌IL-6的水平。rhTSLP促進HUVECs細胞血管生成;抗人TSLP中和性抗體抑制HeLa和CaSki細胞誘導(dǎo)的促進HUVECs血管生成作用。
　　結(jié)論：宮頸癌細胞分泌的TSLP，以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細胞，一方面通過上調(diào)Ki-67表達促進血管內(nèi)皮細胞增殖，但不影響其凋亡;另一方面，通過上調(diào)CD105和CD62E的表

10、達，活化血管內(nèi)皮細胞;此外，通過促進宮頸癌細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌IL-6等促血管生成因子，進一步促進新生血管形成。
　　第三部分宮頸癌細胞分泌的TSLP對癌灶內(nèi)嗜酸性粒細胞功能的調(diào)控作用
　　目的：探討TSLP對癌灶嗜酸性粒細胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集人宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌組織，HE染色分析各組嗜酸性粒細胞的浸潤程度。此外臨床收集各組外周血嗜酸性粒細胞數(shù)量和比例;流式細胞術(shù)分析外周血嗜酸性粒

11、細胞表面TSLPR的表達水平;趨化試驗分析rhTSLP對外周血嗜酸性粒細胞的趨化作用;隨后用rhTSLP處理定向誘導(dǎo)分化嗜酸性粒細胞(HL-60E)，或者建立與宮頸癌細胞株（HeLa和CaSki細胞）的間接共培養(yǎng)體系，ELISA法檢測共培養(yǎng)體系中IL-8、FGF、VEGF和GM-CSF的分泌水平;流式細胞術(shù)分析與HL-60E增殖、凋亡和功能相關(guān)分子的表達水平。
　　結(jié)果：隨著宮頸病變的逐漸進展，病灶部位的嗜酸性粒細胞的浸潤增加，二

12、者呈現(xiàn)明顯的正相關(guān);但是各組之間外周血嗜酸性粒細胞的數(shù)量和比例無明顯差異。外周血嗜酸性粒細胞表達TSLP受體;rhTSLP可以以劑量依賴的方式募集外周血嗜酸性粒細胞;CaSki和HeLa細胞均能明顯上調(diào)HL-60細胞Ki-67、Bcl-2、FasL和Fas的表達;且宮頸癌細胞來源的TSLP可以降調(diào)節(jié)HL-60細胞Fas的表達，但不參與對HL-60細胞Ki-67、Bcl-2和FasL表達調(diào)節(jié);CaSki或HeLa細胞明顯促進HL-60細胞

13、HLA-DR、CD80和CD86的表達;但是宮頸癌細胞分泌的TSLP對于HL-60細胞HLA-DR和CD80的表達無調(diào)節(jié)作用，僅下調(diào)HL-60細胞表面CD86表達;經(jīng)CaSki或HeLa細胞共培養(yǎng)處理后，HL-60細胞表達各種細胞因子的水平均明顯增加，且對于IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-5的調(diào)節(jié)作用可以被rhTSLP、抗TSLP或TSLPR的中和性抗體部分逆轉(zhuǎn);與宮頸癌細胞CaSki或HeLa細胞進行共培養(yǎng)后FGF的分泌水平

14、無改變;雖然HL-60E細胞本身不分泌IL-8，但是可以明顯促進CaSki或HeLa細胞分泌IL-8，且升調(diào)節(jié)共培養(yǎng)體系中VEGF的分泌，且這一效應(yīng)可被共培養(yǎng)體系中引入的抗人TSLP或TSLPR的中和性抗體部分抑制。
　　結(jié)論：宮頸癌灶嗜酸性粒細胞浸潤與腫瘤進展呈明顯正相關(guān);宮頸癌細胞通過分泌TSLP促進臨近組織嗜酸性粒細胞向癌灶趨化的同時，通過刺激IL-5分泌進一步促進癌灶嗜酸性粒細胞祖細胞的分化成熟，并通過下調(diào)嗜酸性粒細胞Fa

15、s表達，抑制其凋亡，共同導(dǎo)致癌灶嗜酸性粒細胞的大量浸潤。TSLP還可以下調(diào)嗜酸性粒細胞CD80表達、IFN-γ和TNF-α的分泌，上調(diào)IL-10和IL-5的分泌，誘導(dǎo)癌灶局部呈現(xiàn)獨特的細胞因子格局，有利于免疫耐受微環(huán)境形成。此外，宮頸癌細胞通過分泌TSLP能進一步加強宮頸癌細胞和嗜酸性粒細胞分泌促血管生成因子，有利于宮頸癌進展。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TSLP對宮頸癌進展具有多重調(diào)節(jié)作用:(1)通過自分泌作用直接上調(diào)Ki-67表

16、達，來促進自身增殖生長;(2)通過旁分泌作用血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、活化和新生血管形成;(3)通過旁分泌作用招募臨近組織嗜酸性粒細胞到達癌灶局部和嗜酸性粒細胞祖細胞分化成熟，進一步抑制嗜酸性粒細胞凋亡，促進嗜酸性粒細胞細胞分泌IL-10和IL-5，抑制其分泌IFN-γ和TNF-α，此外，通過加強宮頸癌細胞和嗜酸性粒細胞之間的相互作用，進而促進微環(huán)境中促血管生成因子IL-8和VEGF的分泌，有利于癌灶周圍血管生成。本研究為完善