SIRTl在宮頸癌發(fā)生中作用的初步研究.pdf

1、目的:第Ⅲ類組蛋白去乙?；敢喾Q為Sirtuins，即沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator2，Sir2）的同源蛋白，研究表明SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究擬通過在組織水平檢測(cè)宮頸癌SIRT1的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系；在細(xì)胞水平研究SIRT1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及其Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，探討SIRTl在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展

2、中的作用機(jī)制及其與Notch-Hes信號(hào)通路的關(guān)系。
　　方法:收集2012年9月-2014年3月青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織石蠟標(biāo)本，選取臨床病理資料完整者221例（包括CIN I級(jí)，CIN II-CIN III級(jí)，宮頸鱗癌及正常宮頸組織）。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SIRT1蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性；化學(xué)合成靶向SIRT1基因的小干擾RNA（siRNA），以Lipofectamine RNAiMA

3、X脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72h后，提取各組總RNA及總蛋白。RT-PCR檢測(cè)SiHa細(xì)胞SIRT1 mRNA的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)SiHa細(xì)胞中SIRT1、Notch1、Hes1及cyclinD1蛋白的表達(dá)，細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiHa細(xì)胞的遷移侵襲能力，分別應(yīng)用AnnexinV-PE雙染法及Hoechst33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示：SIR

4、T1在正常宮頸組織及程度較輕的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINI級(jí)）中未見陽(yáng)性表達(dá)；67例CINII-III組織中有16例SIRT1陽(yáng)性（23.9％）；而54例宮頸癌組織中29例SIRT1表達(dá)陽(yáng)性（53.7％）。RT-PCR結(jié)果表明：與空白細(xì)胞對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、SIRT1陰性對(duì)照組相比，siRNA-SIRT1干擾組細(xì)胞SIRT1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。Western blot顯示：與對(duì)照組相比，siRNA-SIRT1干擾組細(xì)

5、胞SIRT1蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)，cyclinD1、Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：siRNA-SIRTl轉(zhuǎn)染組抑制率為37％，SIRT1陰性對(duì)照組抑制率為8.7％，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組抑制率7.3％，轉(zhuǎn)染組抑制率明顯高于其他組。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，siRNA-SIRT1干擾組穿過人工基底膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明：siRNA

6、-SIRT1干擾組凋亡率為16％而SIRT1陰性對(duì)照組凋亡率僅為2.6％。Hoechst33258染色顯示：siRNA-SIRT1干擾組SiHa細(xì)胞核明顯變小，其染色質(zhì)濃縮，并可見凋亡小體，而SIRT1陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組和空白細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色。
　　結(jié)論:靶向SIRT1基因的siRNA能有效抑制SiHa細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，siRNA-SIRT1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Notch-Hes信號(hào)通路密切相關(guān)