SHP-2在HPV致宮頸癌中的免疫作用.pdf

1、目的：
　　 SHP-2是一個(gè)進(jìn)化上相對(duì)保守的蛋白酪氨酸磷酸酶,由PTPN11編碼的SHP-2也是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶中的一員,并且被認(rèn)為參與許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的激活。在細(xì)胞漿中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路激活后,SHP-2是信號(hào)通路的下游受體。SHP-2作為細(xì)胞傳導(dǎo)通路中負(fù)調(diào)節(jié)因子,可以刺激細(xì)胞增殖和分化。
　　 超過99%子宮頸癌病例是HPV感染的結(jié)果,大約70%是HPV16/18感染所致。盡管HPV感染與宮頸

2、癌有因果關(guān)系存在,但確切機(jī)制仍不清楚。在病毒激活的免疫反應(yīng)中,SHP-2常會(huì)伴隨出現(xiàn),一般認(rèn)為SHP-2是這類免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。SHP-2還可能抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化。由以前的研究可知,SHP-2抑制TRIF依賴的Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,故在宮頸組織中SHP-2也作為負(fù)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。
　　 目前,宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理還不十分清楚,預(yù)防和治療手段遠(yuǎn)非完善,治療效果也不盡如人意。為了探討宮頸癌患

3、者SHP-2的表達(dá)是否有變化,研究SHP-2與HPV感染之間的關(guān)系,本研究選取45例宮頸癌患者,32例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者(CIN),14例正常宮頸進(jìn)入本研究。本研究從宮頸組織、血液及細(xì)胞三個(gè)水平檢測(cè)HPV感染相關(guān)的宮頸病變中免疫調(diào)節(jié)因子SHP-2的表達(dá)狀況,HPV感染狀況及IFN-B等細(xì)胞因子變化,可以明確SHP-2與HPV感染相關(guān)的宮頸病變的關(guān)系,以期證實(shí)HPV感染的宮頸癌患者中SHP-2高表達(dá),兩者之間有相關(guān)性。HPV感染后通過SH

4、P-2負(fù)調(diào)控IFN-β信號(hào)通路,抑制IFN-β的產(chǎn)生,最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。
　　 方法：
　　 一、SHP-2在宮頸病變組織中的表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系
　　 1、樣本選擇
　　 選擇中國(guó)醫(yī)大盛京醫(yī)院2008年6月～2009年12月婦產(chǎn)科住院患者進(jìn)入本研究。45例宮頸癌(Ⅰ-Ⅲ期)患者,年齡從30歲到70歲,平均年齡48歲。32例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者(Ⅰ-Ⅱ),年齡從30歲到60歲,平均年齡4

5、2歲。14例正常宮頸患者,年齡從30歲到62歲,平均年齡45歲。取材前均未接受任何治療。宮頸組織診斷在盛京醫(yī)院病理科。
　　 2、免疫組織化學(xué)法
　　 分別檢測(cè)IFN-β和SHP-2蛋白在上述三組患者宮頸組織中的表達(dá)情況。
　　 3、導(dǎo)流雜交法檢測(cè)HPV16/18
　　 檢測(cè)HPV在上述三組患者宮頸組織中的表達(dá)情況。
　　 4、Real-timePCR法
　　 檢測(cè)SHP-2的基因在上述三

6、組患者宮頸組織中的表達(dá)情況。
　　 二、SHP-2和IFN-B在宮頸病變患者血液中的表達(dá)情況
　　 1、樣本選擇
　　 選擇中國(guó)醫(yī)大盛京醫(yī)院2008年6月～2009年12月婦產(chǎn)科住院患者進(jìn)入本研究。45例宮頸癌(Ⅰ-Ⅲ期)患者,年齡從30歲到70歲,平均年齡48歲。32例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者(Ⅰ-Ⅱ),年齡從30歲到60歲,平均年齡42歲。14例正常宮頸患者,年齡從30歲到62歲,平均年齡45歲。取材前均

7、未接受任何治療。宮頸組織診斷在盛京醫(yī)院病理科。
　　 2、Ficoll分層液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞
　　 取上述三組患者新鮮抗凝血,用Ficoll分層液分離出人外周血單個(gè)核細(xì)胞。
　　 3、Westernblot方法
　　 檢測(cè)上述三組患者人外周血單個(gè)核細(xì)胞中SHP-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 4、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)
　　 檢測(cè)上述三組患者人外周血IFN-B的表達(dá)情況。
　　 三、Si

8、RNA沉默THP-1細(xì)胞中SHP-2的表達(dá)后負(fù)調(diào)控IFN-B的產(chǎn)生
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的完全EMEM培養(yǎng)液(formulatedEagle'sMinimumEssentialMedium)。
　　 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%熱滅活的FBS和0.05mM的(2-mercaptoethanol)的RPMI1640培養(yǎng)液。
　　 上述兩個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)。
　　 2、

9、干擾SHP-2基因的表達(dá)
　　 SHP-2siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,干擾SHP-2基因的表達(dá)。
　　 3、SHP-2封閉肽(blockingpeptide)封閉實(shí)驗(yàn)
　　 將SHP-2封閉肽以不同濃度(0、0.5、2.5ug/m1)和時(shí)間(2h和24h),作用于THP-1細(xì)胞,進(jìn)行WesternBlotting實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SHP-2的表達(dá),確定封閉的最佳時(shí)間和濃度。
　　 4、Western

10、Blotting法檢測(cè)THP-1細(xì)胞中SHP-2蛋白表達(dá)情況
　　 分別收集正常的THP-1細(xì)胞和不同處理因素的THP-1細(xì)胞,WesternBlotting法檢測(cè)THP-1細(xì)胞中SHP-2蛋白表達(dá)。
　　 5、MTT實(shí)驗(yàn)
　　 將THP-1細(xì)胞及不同處理因素處理好的THP-1細(xì)胞分別與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)后,在選定的時(shí)間和濃度點(diǎn)測(cè)其OD值。
　　 6、測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-B的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA

11、)
　　 分別收集培養(yǎng)THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)上清、給予SHP-2封閉肽作用的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清和給予SHP-2siRNA干擾的THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)上清,進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 一、SHP-2和IFN-B在宮頸病變組織中的表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系
　　 1、SHP-2在宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中的表達(dá)結(jié)果。
　　 SHP-2在子宮頸癌組織中高表達(dá)。SHP-2的表達(dá)在宮頸癌及

12、正常宮頸之間有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=13.17,P＜0.05)。SHP-2的表達(dá)在宮頸癌和CIN之間有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.57,P＜0.05)。雖然SHP-2在CIN中表達(dá)率高于正常宮頸,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=1.52,P＞0.05)。
　　 2、IFN-B在宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中的表達(dá)結(jié)果。
　　 IFN-β表達(dá)在宮頸癌及正常宮頸之間有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=6.61,P＜0

13、.05)。IFN-β的表達(dá)在宮頸癌和CIN之間有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.69,P＜0.05)。雖然IFN-β在正常宮頸的表達(dá)率比在CIN高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=0.36,P＞0.05)。
　　 3、SHP-2的mRNA在宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中的表達(dá)結(jié)果。
　　 SHP-2的mRNA在宮頸癌組織的表達(dá)高于正常宮頸組織,有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.177,p＜0.05)。SHP-2在癌組織中

14、的表達(dá)高于CIN組織,有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.624,P＜0.05)。
　　 4、HPV16/18在宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中的表達(dá)結(jié)果。
　　 HPV16/18在正常宮頸的感染率是14.3%,在CIN的感染率是68.7%,在子宮頸癌的感染率是84.4%。
　　 5、HPV16/18感染和SHP-2在不同宮頸組織中的表達(dá)的相關(guān)性分析。采用Spearman相關(guān)分析,分析了HPV感染的宮頸癌中SHP-

15、2表達(dá)和無HPV感染的正常宮頸之間的相關(guān)性,結(jié)果證實(shí)HPV感染和SHP.-2在宮頸癌組織中的表達(dá)有相關(guān)性(rs=0.582,P＜0.05)。二、SHP-2和IFN.B在宮頸病變患者血液中的表達(dá)情況1、分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的結(jié)果離心后離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。第一層:為血漿或組織勻漿層。第二層:為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層:為透明分離液層。第四層:為紅細(xì)胞層(此層表面有懸起的部分白細(xì)胞側(cè)層收集屆面上的細(xì)胞)。收集第二層細(xì)胞。

16、r>　　 2、SHP-2蛋白在宮頸癌、CIN、正常宮頸患者外周血的表達(dá)結(jié)果。
　　 由westernblot影像可以看出正常宮頸患者蛋白的條帶顯影非常淺,CIN患者蛋白的條帶顯影稍淺,而宮頸癌患者蛋白的條帶顯影非常深。
　　 3、IFN-B在宮頸癌、CIN、正常宮頸患者外周血的表達(dá)結(jié)果。
　　 宮頸癌組與正常宮頸組間有顯著差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.696,p＜0.05);宮頸癌組與CIN組間有顯著差異,差

17、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.465,p＜0.05);CIN組與正常宮頸組間無顯著差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.632,p＞0.05)。
　　 三、SiRNA沉默THP-1細(xì)胞中SHP-2的表達(dá)后負(fù)調(diào)控IFN-B的產(chǎn)生
　　 1、給予SHP-2的SiRNA后SHP-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 給予SHP-2的SiRNA后SHP-2蛋白表達(dá)明顯降低,在干擾后48h、200pmol時(shí)干擾效果最好。
　　 2、給予S

18、HP-2的封閉抗體后SHP-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 給予SHP-2的封閉抗體后SHP-2蛋白表達(dá)明顯降低,在封閉后24h、2.5ug/ml時(shí)抑制效果最好。
　　 3、MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　 (1)THP-1細(xì)胞與SiHa細(xì)胞相互作用。
　　 更換新的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液的0D值明顯高于不換培養(yǎng)液的0D值,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從兩個(gè)細(xì)胞作用時(shí)間來看,THP-1細(xì)胞對(duì)SiHa細(xì)胞殺傷作用隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增

19、強(qiáng),從24小時(shí)起就起明顯作用。
　　 (2)SiRNA干擾和封閉肽作用的THP-1細(xì)胞與SiHa細(xì)胞作用。
　　 給予siRNA干擾的THP-1細(xì)胞對(duì)SiHa細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)(oD值最低),給予封閉肽的次之,無處理因素的最弱(0D值最高)。
　　 4、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)IFN-B的結(jié)果。
　　 SiRNA干擾組的濃度值最高,其次是封閉肽組的濃度值,無處理因素組(僅培養(yǎng)THP-1的細(xì)胞組)的濃度值最低(如

20、圖7所示)。SiRNA干擾組與無處理因素組之間有顯著差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.981,P＜0.05)。封閉肽組與無處理因素組之間有差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.333,P＜0.05)。SiRNA干擾組與封閉肽組之間有差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.648,P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、SHP-2在宮頸癌患者組織及血液中高表達(dá)。
　　 2、IFN-β在宮頸癌患者組織及血液中低表達(dá)。