癌細胞片狀偽足形成的惡性行為表型及其分子機制.pdf

1、癌癥的惡性程度與癌細胞的惡性行為表型密切相關(guān)，癌細胞有三個基本表型特征：不死性、遷移性和失去接觸抑制。當然，癌細胞還有許多不同于其他正常細胞的生理、生化和形態(tài)特征，如異倍體、代謝異常、耐藥等等。其中癌細胞的遷移性是其常見的惡性表型之一，而癌細胞的遷移能力直接決定了其惡性的程度。癌細胞遷移涉及到細胞粘附的減少、細胞骨架的重排、細胞外基質(zhì)的降解和細胞突出及偽足的形成，其中癌細胞的偽足尤其是片狀偽足的形成是癌細胞遷移能力強弱的關(guān)鍵所在。偽足一

2、般劃分為絲狀偽足、片狀偽足、侵襲偽足和足體。作為細胞膜的特化結(jié)構(gòu)，這四種偽足有著不同的功能：絲狀偽足主要負責細胞粘附，而片狀偽足對于細胞的長距離遷移有著重要的作用。HAb18G/CD147分子作為一個腫瘤標志物，高表達于多種癌細胞表面。已有多篇文獻報道HAb18G/CD147分子對癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要的影響，但其具體的影響機制還有待進一步的闡明。
　　因此，為了進一步了解HAb18G/CD147分子與癌細胞惡性行為表型尤其是癌

3、細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，是否通過改變癌細胞偽足形成來調(diào)節(jié)癌細胞的運動，我們利用多種細胞生物學及分子生物學手段，證明了HAb18G/CD147分子通過Fak和Src的磷酸化使Cortactin分子活化，活化的Cortactin分子能夠作為支架蛋白維持Arp2/3復合物的穩(wěn)定，進一步促使Actin在細胞前緣（Leading-edge）形成樹突狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)即片狀偽足，最終促進癌細胞運動能力。本研究最終闡明了HAb18G/CD147促進癌細胞轉(zhuǎn)

4、移的分子生物學機制。
　　第一部分：HAb18G/CD147促進癌細胞片狀偽足的形成介導癌細胞的轉(zhuǎn)移
　　HAb18G/CD147早已被多篇文獻證明能夠影響癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，不論是干涉HAb18G/CD147分子的表達，還是通過抗體特異的封閉HAb18G/CD147分子的功能，都能夠抑制癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。但是對于HAb18G/CD147分子怎樣促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，還有待深入闡述。
　　首先，為了確認HAb18G/C

5、D147對癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們利用穩(wěn)定干涉HAb18G/CD147的癌細胞系（knock down）和HAb18G/CD147基因敲除的癌細胞系（knock out），transwell實驗發(fā)現(xiàn)降低或敲除HAb18G/CD147表達能夠顯著抑制癌細胞的遷移能力。細胞軌跡追蹤實驗證實，HAb18G/CD147表達下降能夠顯著下調(diào)癌細胞的運動速率。這些實驗都提示我們HAb18G/CD147表達變化能夠顯著影響癌細胞的運動能力。進一

6、步利用高分辨率的激光共聚焦顯微鏡通過活細胞劃痕實驗觀察細胞運動過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，低表達HAb18G/CD147的癌細胞在運動過程中片狀偽足形成明顯很少，免疫熒光染色實驗確認了此結(jié)果。本部分的研究結(jié)論：HAb18G/CD147表達下降能夠顯著降低癌細胞的運動能力，而這種影響的主要表現(xiàn)就是癌細胞片狀偽足形成的減少。
　　第二部分：HAb18G/CD147影響癌細胞片狀偽足形成的分子機制
　　為了揭示HAb18G/CD1

7、47促進癌細胞片狀偽足形成的分子機制，我們首先利用第一部分構(gòu)建的HAb18G/CD147穩(wěn)轉(zhuǎn)干涉的癌細胞系（knock down）和
　　HAb18G/CD147基因敲除癌細胞系（knock out），通過蛋白免疫印跡實驗檢測了與片狀偽足形成相關(guān)分子的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147表達下降并沒有影響片狀偽足形成相關(guān)分子的表達水平，卻影響了Fak、Src和Cortactin的酪氨酸磷酸化水平。使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗分別

8、檢測HAb18G/CD147、Fak、Src和Cortactin之間的兩兩相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147與Fak、Fak與Src、Src與Cortactin分別能夠兩兩相互作用。進一步通過點突變Cortactin的酪氨酸位點，活細胞實時觀察及侵襲小室實驗確定了Cortactin的酪氨酸磷酸化是片狀偽足形成的關(guān)鍵。
　　通過以上結(jié)果我們得出結(jié)論：HAb18G/CD147表達促進癌細胞片狀偽足的形成是通過HAb18G/CD

9、147、Fak、Src和Cortactin分子間的逐級磷酸化來實現(xiàn)的。
　　第三部分：HAb18G/CD147促進癌細胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究
　　本部分研究的目的是通過一系列的動物實驗在體內(nèi)證明HAb18G/CD147對癌細胞轉(zhuǎn)移的影響，以及通過收集臨床病例，分析HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期的關(guān)系。
　　我們通過經(jīng)尾靜脈注射癌細胞的方法構(gòu)建裸鼠轉(zhuǎn)移模型，到達時間點處死解剖裸鼠，取肺臟及肝臟進行HE染色，發(fā)現(xiàn)

10、HAb18G/CD147對于癌細胞的肝臟轉(zhuǎn)移有顯著影響；通過雙光子顯微鏡觀察也印證了這一結(jié)果，這些體內(nèi)實驗結(jié)果都提示我們HAb18G/CD147對癌細胞轉(zhuǎn)移的影響。
　　另外，我們又通過收集臨床病例，分析了HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期有相關(guān)性；這些臨床病例分析結(jié)果也證明HAb18G/CD147分子促進了癌的進展。
　　綜上所述，HAb18G/CD