WAVE1在上皮性卵巢癌惡性行為中的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、卵巢惡性腫瘤、子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器最常見的三大惡性腫瘤。卵巢惡性上皮性腫瘤占卵巢惡性腫瘤的85～90％。上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）在女性生殖道惡性腫瘤中死亡率最高，全世界每年有近204，000女性診斷患有卵巢癌，近125，000死于該疾病，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。卵巢癌起病隱匿、原發(fā)灶隱蔽，患者早期缺少臨床癥狀、不易發(fā)現(xiàn)，3/4的患者初診時(shí)通常已經(jīng)進(jìn)展到疾病中晚期（FIGOⅢ～

2、Ⅳ期），且腫瘤具有易播散轉(zhuǎn)移、術(shù)后易復(fù)發(fā)且易產(chǎn)生化療耐藥等特點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)和科技水平的進(jìn)步，即使采取了包括臨床腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和聯(lián)合化療等綜合治療手段，并改進(jìn)了外科手術(shù)方法、增加了新的化療方案，對(duì)于最常見的EOC，長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)、外的資料顯示該疾病患者5年生存率始終停留在30％左右。卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移惡性行為是導(dǎo)致卵巢癌治療失敗，死亡的主要原因，因此它的惡性生物學(xué)行為及其分子生物學(xué)機(jī)制一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。
　　惡性腫瘤的發(fā)生、

3、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，癌細(xì)胞先在原位生長(zhǎng)，而后向鄰近組織侵襲，使其發(fā)生破壞，然后從原發(fā)灶脫離，侵入血道、淋巴道，進(jìn)而在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移瘤。在這一過(guò)程中，癌細(xì)胞向鄰近組織的侵襲生長(zhǎng)是腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的起始步驟，而這種對(duì)鄰近組織的侵襲性又依賴于癌細(xì)胞的定向極化運(yùn)動(dòng)能力，即癌細(xì)胞偽足往某一方向持續(xù)延伸的動(dòng)力，這一動(dòng)力是通過(guò)肌動(dòng)蛋白的聚合所提供。因此探討癌細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)機(jī)制，進(jìn)而控制肌動(dòng)蛋白在癌細(xì)胞偽足部位的聚合，可以達(dá)到早期控制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)

4、移的目的。課題組前期研究采用反向捕獲抗體芯片技術(shù)在對(duì)“吸煙與粘液性卵巢癌的發(fā)病相關(guān)性研究”和在“上皮性卵巢癌早期診斷研究”中發(fā)現(xiàn)，Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族富含脯氨酸同源蛋白1（Wiskott-Aldrich syndromeprotein family verprolin-homologous protein1，WAVE1）是同時(shí)存在于兩組研究結(jié)果中血清抗體的差異性表達(dá)蛋白，可能是EOC細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志蛋白。WAVE1

5、基因在1998年發(fā)現(xiàn)并命名，主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞信號(hào)從酪氨酸激酶受體和Rac傳遞至細(xì)胞骨架，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合及細(xì)胞骨架重排的作用并最終形成片狀偽足。研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤、前列腺癌、白血病等惡性腫瘤中，WAVE1均高度表達(dá)，提示W(wǎng)AVE1在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)WAVE1在EOC惡性行為中的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本課題將分為以下四部分對(duì)WAVE1在EOC惡性行為中的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　第一部

6、分
　　WAVE1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義.
　　目的:
　　檢測(cè)WAVE1在EOC組織標(biāo)本中的蛋白表達(dá)情況，探討EOC組織中WAVE1的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　(1)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)223例EOC組織標(biāo)本，29例交界性卵巢腫瘤標(biāo)本，44例良性腫瘤標(biāo)本和24例正常卵巢組織標(biāo)本中WAVE1的表達(dá)情況，分析WAVE1的異常表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　(2)采

7、用Western blot法檢測(cè)其中44例EOC組織標(biāo)本，16例交界性卵巢腫瘤標(biāo)本，32例良性腫瘤標(biāo)本和22例正常卵巢組織標(biāo)本中WAVE1的表達(dá)情況，并分析WAVE1的異常表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　(3)采用Kaplan-Meier生存分析比較EOC患者組織中WAVE1表達(dá)強(qiáng)弱對(duì)生存時(shí)間的影響;Cox回歸分析探討有關(guān)EOC患者生存時(shí)間的影響因素。
　　(4)應(yīng)用Western blot法檢測(cè)EOC細(xì)胞株SKOV3，

8、OVCAR-3，ES-2和3AO細(xì)胞中WAVE1蛋白表達(dá)情況，采用激光共聚焦顯微鏡分析WAVE1在卵巢癌細(xì)胞株中的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在223例EOC組織中，163例(73.1％)呈WAVE1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，60例(26.9％)呈WAVE1低表達(dá)或不表達(dá);在交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中分別有23例(79.3％)、37例(84.1％)、23例(95.8％)呈WAVE1不表達(dá)，差

9、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在EOC組織中，WAVE1蛋白的表達(dá)水平在FIGOⅢ～Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.001)，中低分化細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于高分化(P＜0.001)，血漿Ca-125≥35 U/ml的EOC患者組織中表達(dá)顯著高于Ca-125＜35 U/ml的患者組織(P=0.013)，術(shù)后殘余瘤≥1 cm的EOC患者組織中表達(dá)顯著高于術(shù)后殘余瘤＜1 cm的患者組織(P-0.036)，但與EOC患者年齡、病理類型、腫

10、瘤大小、腹水及病灶單雙側(cè)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。
　　(2) Western blot結(jié)果顯示，WAVE1在EOC組織中的表達(dá)（0.930±0.188）顯著高于交界性卵巢腫瘤（0.586±0.098）、良性卵巢腫瘤(0.542±0.103)和正常卵巢組織（0.441±0.097），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在EOC組織中，WAVE1蛋白的表達(dá)水平與EOC FIGO分期、組織分化、血漿Ca-125及術(shù)后殘余瘤有關(guān)(P＜0.0

11、5)，而與患者年齡、病理分型、腫瘤大小、腹水、病灶單雙側(cè)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。
　　(3)生存分析顯示W(wǎng)AVE1低表達(dá)的EOC患者生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于WAVE1高表達(dá)患者(P＜0.05)，多變量分析表明WAVE1高表達(dá)、EOC分期中晚期和不理想的腫瘤減滅術(shù)分別是EOC預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　(4)WAVE1在EOC細(xì)胞株SKOV3，3AO，OVCAR-3和ES-2細(xì)胞中均為高表達(dá)（分別為1.218

12、±0.112，1.111±0.084，1.057±0.148，和0.968±0.055）;激光共聚焦顯微鏡觀察到WAVE1與肌動(dòng)蛋白均共表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。
　　結(jié)論:
　　WAVE1在EOC組織和細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)。高水平WAVE1與EOC分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值和術(shù)后殘余瘤有關(guān)。WAVE1的高表達(dá)與EOC侵襲和不良預(yù)后有關(guān)，提示W(wǎng)AVE1可能在EOC惡性行為中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分<

13、br>　　WAVE1基因特異性shRNA慢病毒體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株的篩選。
　　目的:
　　應(yīng)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建WAVE1的短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，構(gòu)建篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)設(shè)計(jì)并化學(xué)合成兩對(duì)含高效的靶向WAVE1基因的重組質(zhì)粒和陰性對(duì)照。通過(guò)雙酶切

14、實(shí)驗(yàn)和DNA測(cè)序法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
　　(2)將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒及慢病毒包裝質(zhì)粒，通過(guò)Lipofectamine TM2000共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后收集、提純、測(cè)定滴度。采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　(3)采用Western blot法和Real time PCR法分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中WAVE1蛋白和mRNA表達(dá)量的變化，驗(yàn)證和篩選WAVE1基因抑制

15、效應(yīng)顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　結(jié)果:
　　(1)成功設(shè)計(jì)并合成兩條WAVE1特異性shRNA，雙酶切實(shí)驗(yàn)和DNA測(cè)序報(bào)告顯示，基因重組技術(shù)成功構(gòu)建WAVE1基因RNA干擾慢病毒載體，測(cè)定滴度為2.2×108U/ml。
　　(2)慢病毒載體介導(dǎo)的WAVE1-shRNA1、WAVE1-shRNA2和陰性對(duì)照成功轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，采用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。
　　(3)通過(guò)Western blo

16、t法與Real time PCR法檢測(cè)、驗(yàn)證和篩選，獲得WAVE1基因抑制效果顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EOC細(xì)胞株SKOV3-Ri1細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　成功靶向構(gòu)建了WAVE1基因的特異性重組質(zhì)粒。利用慢病毒載體成功篩選獲得了WAVE1基因抑制效果顯著的卵巢癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究WAVE1惡性生物學(xué)行為及其分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分
　　慢病毒介導(dǎo)的WAVE1基因沉默對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞惡行為的影響。<

17、br>　　目的:
　　探討WAVE1基因沉默后對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、粘附和侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　(1)采用激光共聚焦顯微鏡觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　(2) Transwell小室檢測(cè)WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的遷移、侵襲能力變化。
　　(3)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)分析WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的粘附功能改變。
　　(4) MTT

18、比色法測(cè)定WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的增殖能力改變。
　　(5)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的群體依賴性和增殖能力變化。
　　(6)裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細(xì)胞的成瘤能力變化。
　　結(jié)果:
　　(1)干擾WAVE1表達(dá)能夠使EOC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化:
　　激光共聚焦顯微鏡觀察到，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞呈現(xiàn)

19、去極化，絲狀偽足、片狀偽足形成能力顯著減弱，形態(tài)變圓。
　　(2)干擾WAVE1表達(dá)能夠抑制EOC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力:
　　Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸脂膜的遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。
　　Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞穿過(guò)Matrigel的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜

20、0.05)。
　　細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞的粘附能力顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)干擾WAVE1表達(dá)能夠抑制EOC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的惡性程度:
　　MTT法檢測(cè)EOC細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)染后1d、2d、3d、4d和5d，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較平緩，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減緩(P＜0.05)。
　　軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

21、顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，克隆形成數(shù)目顯著減少(P＜0.05)。
　　(4)干擾WAVE1表達(dá)能夠抑制裸鼠皮下成瘤的惡性行為能力:
　　與陰性對(duì)照組相比，干擾組移植瘤成瘤能力顯著減弱，瘤體生長(zhǎng)速度緩慢，體積減小。
　　結(jié)論:
　　WAVE1基因沉默后改變了卵巢癌細(xì)胞SKOV3的形態(tài)變化，顯著抑制了SKOV3細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力，反向證實(shí)了WAVE1在

22、EOC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移惡性行為中的作用，具有作為EOC預(yù)防、治療基因靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。
　　第四部分
　　WAVE1參與上皮性卵巢癌惡性行為的分子機(jī)制研究。
　　目的:
　　探討WAVE1參與上皮性卵巢癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移惡性行為的可能分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)采用HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化。
　　(2)采用免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)干擾組與陰性對(duì)照組移植瘤組織中與

23、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9和E-cadherin的水平變化。
　　(3)采用Western blot法檢測(cè)WAVE1基因沉默前后卵巢癌細(xì)胞中與增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白AKT與p-AKT，p38 MAPK與p-p38 MAPK，ERK1/2與p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　(1) HE染色后可見，SKOV3-NC組腫瘤細(xì)胞失去極性，排列不規(guī)則，

24、而SKOV3-Ri1組細(xì)胞可見極性，排列相對(duì)整齊。
　　(2)免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果均顯示，與SKOV3-NC相比，SKOV3-Ri1移植瘤組織中cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，而E-cadherin表達(dá)水平上升(P＜0.05)。
　　(3) Western blot法檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的蛋白結(jié)果顯示，SKOV3-Ri1細(xì)胞中AKT蛋白、p-AKT蛋白及p-p38