APC基因表達(dá)在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其蛋白表達(dá)水平與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系
　　 目的：檢測(cè)正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織標(biāo)本中APC蛋白的表達(dá)以及APC基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，了解APC蛋白的表達(dá)水平及其基因啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)性，分析APC蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)(IHC)方法，檢測(cè)正常的卵巢組織、良

2、性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中APC蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.采用western blot(WB)方法，檢測(cè)正常的卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中APC蛋白的表達(dá)水平。
　　 3.采用甲基化特異性PCR(MSP)方法，檢測(cè)正常的卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中APC基因啟動(dòng)子甲基化狀況。
　　 4.分析

3、上皮性卵巢癌組織中，APC蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.IHC顯示，在正常的卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中，APC的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低。與正常卵巢組織相比，APC蛋白表達(dá)在交界性上皮性卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌組織中明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且上皮性卵巢癌組織中的APC蛋白表達(dá)明顯低于交界性上皮性卵巢腫瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.WB結(jié)果

4、顯示，在正常的卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中，APC蛋白表達(dá)水平逐漸降低。與正常卵巢組織相比，APC蛋白表達(dá)水平在交界性上皮性卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌組織中明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且上皮性卵巢癌組織中的APC蛋白表達(dá)水平明顯低于交界性上皮性卵巢腫瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.MSP結(jié)果顯示，在正常的卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤以及上皮性卵巢癌組織中，APC基因

5、啟動(dòng)子甲基化水平逐漸升高。在上皮性卵巢癌組織中，APC基因啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)。
　　 4.在不同手術(shù)病理分期、不同病理分級(jí)的上皮性卵巢癌中，APC蛋白的表達(dá)水平不同;手術(shù)病理分期越晚、病理分化程度越低，APC蛋白表達(dá)水平越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.APC蛋白在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起抑制作用，其異常低表達(dá)導(dǎo)致了上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 2.APC基因啟動(dòng)子

6、區(qū)的異常高甲基化可能是其蛋白表達(dá)水平降低的原因，從而進(jìn)一步引起了上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 第二部分 APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)卵巢癌細(xì)胞APC的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制的研究
　　 目的：研究利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2'-deoxycytidine處理卵巢癌細(xì)胞株后，檢測(cè)APC蛋白及mRNA的表達(dá)情況、APC基因啟動(dòng)子甲基化水平，觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、侵襲能力的影響;同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中與

7、APC相互作用的分子β-catenin、p-β-catenin及Wnt信號(hào)通路重要的靶基因C-myc、cyclinD1的表達(dá)情況，深入研究APC抑制上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.篩選細(xì)胞株:采用WB方法，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株3AO、ES-2、SKOV3和OVCAR-3中APC蛋白的表達(dá)，篩選出APC低表達(dá)的兩種細(xì)胞株進(jìn)行下一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究。
　　 2.甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2

8、'-deoxycytidine濃度的確定:甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2'-deoxycytidine對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，因此設(shè)置0.1-2.0uM8個(gè)濃度，MTT法求細(xì)胞抑制率，篩選出對(duì)卵巢癌細(xì)胞低毒有效的作用濃度（即細(xì)胞抑制率＜20％的藥物濃度）。
　　 3.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的、上述實(shí)驗(yàn)篩選出的兩種細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，接種后24小時(shí)，向細(xì)胞中加入由前述步驟所確定的濃度的5-Aza-2'-deoxycytidine。未加

9、藥組以及加藥組加藥后24小時(shí)，采用western blot方法，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株中APC蛋白的表達(dá)情況;采用RT-PCR方法，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株中APC基因mRNA的表達(dá)情況;采用MSP方法，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株中APC基因啟動(dòng)子甲基化情況。
　　 4.以未加藥組為對(duì)照，加入上述確定濃度的5-Aza-2'-deoxycytidine后24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化、細(xì)胞凋亡的變化，transwell檢測(cè)兩種細(xì)胞株細(xì)

10、胞侵襲能力的變化。
　　 5.以未加藥組為對(duì)照，加入上述確定濃度的5-Aza-2'-deoxycytidine后24小時(shí)，WB檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中與APC相互作用的分子β-catenin、p-β-catenin及Wnt信號(hào)通路重要的靶基因C-myc、cyclinD1的表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Westem blot結(jié)果顯示，在卵巢癌細(xì)胞株3AO、ES-2、SKOV3和OVCAR-3中，APC蛋白均

11、呈低表達(dá)，篩選出SKOV3和OVCAR-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.根據(jù)MTT（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）結(jié)果，篩選出對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和OVCAR-3低毒有效的作用濃度，確定為1.0 uM。
　　 3.加入1.0 uM的5-Aza-2'-deoxycytidine24小時(shí)后，與對(duì)照相比，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及OVCAR-3中APC蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;APC基因啟動(dòng)子甲基化水

12、平降低，非甲基化水平升高。
　　 4.對(duì)加入1.0μM的5-Aza-2'-deoxycytidine前后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期以及transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果顯示:與對(duì)照相比，加入5-Aza-2'-deoxycytidine后的SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞凋亡明顯增加，處于G2/M期的細(xì)胞明顯減少，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.對(duì)加入1.0 uM的5-Aza-2'-de

13、oxycytidine前后的細(xì)胞進(jìn)行Western blotting技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中與APC相互作用的分子β-catenin、p-β-catenin及Wnt信號(hào)通路重要的靶基因C-myc、cyclinD1的表達(dá)水平結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，加入5-Aza-2'-deoxycytidine后的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、OVCAR-3中β-catenin蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差異;但磷酸化β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

14、義; Wnt信號(hào)通路重要的靶基因C-myc表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但cyclinD1的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.加入5-Aza-2'-deoxycytidine，抑制APC基因啟動(dòng)子甲基化水平后，能有效恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞APC蛋白及mRNA的表達(dá)，說(shuō)明卵巢癌細(xì)胞APC低表達(dá)的原因與APC基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化有關(guān)。
　　 2.逆轉(zhuǎn)APC基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)，恢復(fù)其表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的生