53BP1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌，是威脅全世界女性健康的惡性腫瘤之一。WTO統(tǒng)計(jì)資料顯示:在全世界女性生殖道惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率均僅次于宮頸癌而位居第二位，因此有必要研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律及機(jī)制，為尋求有效的治療方法，改善患者預(yù)后奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)卵巢癌也是一種基因型疾病，其形成和病情演進(jìn)與基因突變有關(guān)，包括抑癌基因的失活或者癌基因的激活。53BP1是內(nèi)源性雙鏈DNA損傷的標(biāo)志分子之一，主要參

2、與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)，觸發(fā)受損細(xì)胞的周期阻滯以穩(wěn)定細(xì)胞的遺傳信息，從而防止腫瘤的形成和進(jìn)展。本課題主要探討53BP1在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外鮮有這方面的報(bào)道。課題的研究?jī)?nèi)容主要包括以下部分:
　　 一、53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力影響的研究;
　　 二、53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力及順鉑耐藥性影響的研究;
　　 三、53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞裸小鼠致瘤能力影響的研究。
　　 第

3、一部分:53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力影響的研究
　　 背景和目的:目前，研究者對(duì)53BP1在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)體系中的重要作用已經(jīng)做了大量的研究。但是53BP1究竟在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演什么角色，迄今為止鮮有報(bào)道。此項(xiàng)研究的目的就是調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌細(xì)胞中53BP1基因的表達(dá)水平，觀察53BP1蛋白改變對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，并探求由53BP1觸發(fā)的相應(yīng)機(jī)制。材料和方法:選取上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞作為研

4、究對(duì)象，通過(guò)DNA脂質(zhì)體將53BP1的表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，使SKOV3細(xì)胞中的53BP1蛋白過(guò)表達(dá)或者降調(diào)解。分別通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，克隆形成能力實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、克隆形成率、細(xì)胞周期及凋亡率，分析53BP1蛋白改變后，SKOV3細(xì)胞的增殖能力的變化。Westernblot檢測(cè)Bcl-2，p-Akt，Bax及P21waf(1)/cip(1)等細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果:當(dāng)SKOV3細(xì)胞中

5、53BP1蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，其生長(zhǎng)速度變慢，克隆形成能力減弱（過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53BP1細(xì)胞:(1)34±9克隆/500細(xì)胞，對(duì)照組SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞:(5)2±22克隆/500細(xì)胞），另外細(xì)胞表現(xiàn)出G2/M期阻滯（過(guò)表達(dá)組:26.68±2.11％，對(duì)照組13.02±1.30％），細(xì)胞凋亡率增加(過(guò)表達(dá)組:23.48±3.20％，對(duì)照組:9.34±2.12％)(P＜0.05)。細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯的

6、蛋白，Bax及P21waf(1)/cip(1)，表達(dá)增強(qiáng)。凋亡抑制因子及促增殖蛋白，Bcl-2及p-Akt，表達(dá)減弱。當(dāng)降調(diào)SKOV3細(xì)胞中的53BP1蛋白時(shí)，其結(jié)果與過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)相一致。結(jié)論:53BP1通過(guò)抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖能力阻滯其發(fā)生發(fā)展。
　　 第二部分:53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力及順鉑耐藥性影響的研究
　　 背景和目的:卵巢癌預(yù)后差，一是因?yàn)榘┘?xì)胞在盆腔及腹腔的廣泛播散致使手術(shù)治療不徹底;二是緣于癌細(xì)

7、胞對(duì)藥物產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本部分研究的目的是探討53BP1與卵巢癌細(xì)胞侵襲能力及順鉑耐藥性之間的關(guān)系及其相關(guān)機(jī)制。材料和方法:通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，改變上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3中53BP1的表達(dá)水平.通過(guò)transwell侵襲實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)穿膜貼壁細(xì)胞的數(shù)目，檢測(cè)過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53BP1細(xì)胞，干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1細(xì)胞及其相應(yīng)對(duì)照組SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞，SKO

8、V3/pSUPER-vector細(xì)胞侵襲能力的改變。明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9的表達(dá)情況。MTT及westernblot方法分別檢測(cè)不同濃度的順鉑作用72小時(shí)后，53BP1對(duì)各組細(xì)胞化療敏感性的影響及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平改變。結(jié)果:與對(duì)照組SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞（230±58細(xì)胞）相比較，過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53BPl細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱（45±12細(xì)胞）(P＜0.05)，MMP-

9、9分泌水平明顯下降，而兩組間MMP-2分泌量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。但是53BP1增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性（過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53BP1細(xì)胞的IC50為7.58±0.51μg/ml，而對(duì)照組SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞的IC50為2.98±0.27μg/ml。P＜0.01）。隨著順鉑作用濃度的逐漸增加，SKOV3/pLPC-53BP1細(xì)胞中P21waf(1)/cip(1)及Bax蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，而

10、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)SKOV3細(xì)胞中的53BP1蛋白表達(dá)降低時(shí)，侵襲和順鉑耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)相一致。結(jié)論:53BP1通過(guò)降調(diào)節(jié)MMP-9的分泌水平抑制SKOV3細(xì)胞的侵襲能力;但是53BP1卻增加了順鉑作用下卵巢癌細(xì)胞的凋亡抑制因子的蛋白水平，增加了SKOV3細(xì)胞的順鉑化療耐藥性。
　　 第三部分:53BP1對(duì)卵巢癌細(xì)胞裸小鼠致瘤能力影響的研究
　　 背景和目的:借助腫瘤動(dòng)物模型，人們能

11、夠更深刻的認(rèn)識(shí)人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，評(píng)價(jià)腫瘤治療方法的優(yōu)劣。動(dòng)物移植瘤模型的形成與否很大程度上依賴于腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因可以降低或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的成瘤率。我們?cè)谇皟刹糠值难芯孔C實(shí)細(xì)胞中53BP1蛋白水平改變可以影響卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生物學(xué)行為，削減其增殖和侵襲能力，本部分研究的目的是探討53BP1對(duì)于裸小鼠卵巢癌皮下移植瘤形成的影響。材料和方法:將前期穩(wěn)篩成功的卵巢癌細(xì)胞（過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53

12、BP1細(xì)胞及干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1，其對(duì)照組分別為SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞和SKOV3/pSUPER-vector細(xì)胞）接種于裸小鼠皮下（每組8只裸小鼠），觀察并比較各組動(dòng)物的腫瘤形成時(shí)間，裸小鼠生物學(xué)行為的改變，測(cè)量移植瘤的大小及生長(zhǎng)速度，應(yīng)用Kaplan-Meier及l(fā)og-rank方法分析各組荷卵巢癌裸小鼠生存時(shí)間的差異，探討53BP1對(duì)于裸小鼠皮下移植瘤致瘤能力的影響。結(jié)果:四種卵巢癌細(xì)胞的裸小

13、鼠皮下移植瘤成功率均為100％。裸小鼠皮下成瘤時(shí)間過(guò)表達(dá)組SKOV3/pLPC-53BP1細(xì)胞最長(zhǎng)為28.50±2.07天，移植瘤大小為0.53±0.12cm（接種60天時(shí)），其對(duì)照組SKOV3/pLPC-vector細(xì)胞成瘤時(shí)間為22.88±2.90天，移植瘤大小1.12±0.23cm（接種60天時(shí)）(P＜0.05);干擾組SKOV3/pSUPER-53BP1細(xì)胞成瘤時(shí)間最短為14.88±1.46天，移植瘤大小2.52±0.72cm（

14、接種60天時(shí)），其對(duì)照組SKOV3/pSUPER-vector細(xì)胞成瘤時(shí)間為20.75±5.34天，移植瘤大小0.94±0.11cm（接種60天時(shí)）(P＜0.05)。Kaplan-Meier及l(fā)og-rank結(jié)果顯示SKOV3/pLPC-53BP1組荷瘤裸小鼠生存時(shí)間較SKOV3/pLPC-vector組明顯延長(zhǎng)（分別為110±5.15天及100±2.97天，P＜0.01），SKOV3/pSUPER-53BP1組荷瘤裸小鼠生存時(shí)間明顯較