saRNA上調p21WAF1-CIP1和VEZT基因對胃癌細胞惡性行為影響的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　胃癌是世界范圍內發(fā)病率最高同時也是致死率最高的惡性腫瘤之一，僅2012年，新診斷的胃癌患者就達到952000人;在我國其發(fā)病率及致死率在所有惡性腫瘤中更是首屈一指。從全球范圍來看，近年來胃惡性腫瘤的發(fā)病率逐年降低，但是由于總人口數目的增多，人均壽命的增長及老年人的增多等不同原因，新的胃惡性腫瘤患者數目在不斷增加。目前認為胃癌的發(fā)生是多種因素相互作用的結果，而癌基因的異常表達是其不可或缺的一部分，即與胃癌發(fā)生發(fā)

2、展相關的原癌基因的異常高表達和/或抑癌基因的反常低表達甚至沉默是導致胃惡性腫瘤不斷進展的重要致病因素，因此深入研究能夠導致胃癌的各種遺傳物質的變化尤其是基因的脫變、缺失等在胃癌進展中的作用機制，找到治療胃惡性腫瘤的新途徑或者是新的靶點，可以為其預防以及治療提出切實可行的的方法或途徑。
　　早在1969年Britten等就已經提出激活RNA(activator RNA)的概念，但未獲得證實，此后直到2006年Li和Janowski等

3、才分別發(fā)現并命名saRNA和RNAa:小分子的雙鏈非編碼RNA可以上調或增強靶基因的表達，而這種效應主要發(fā)生在DNA進行轉錄的時候，因此這種現象叫RNA激活(RNAa)，而這種小分子的雙鏈非編碼RNA則稱為激活小RNA（saRNA）。隨后有關RNAa原理及作用機制的研究被不斷地報道，進一步證實了RNAa的可行性。
　　p21WAF1/ CW1(p21)，是一種受體廣泛的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑，位于6p染色體，編碼分

4、子量為21k-Da的蛋白質，是野生型p53抑癌基因應對各種因素引起的基因損傷的下游激活產物，p21可以通過多種細胞信息傳導途徑調節(jié)細胞周期，改變細胞周期的進程調控細胞的增殖，這其中最為重要的是通過抑制某種特定的CDK復合物的活性，使細胞周期停止在G1期。針對p21WAF1/ CIP1(p21)基因的小激活RNA(saRNA)，dsP21-322，已經在肝癌，肺癌，膀胱癌等多種癌細胞系中驗證了有效性，但是在胃癌細胞中卻未見相關報道。本研究

5、擬應用RNA激活技術重新激活胃癌細胞中p21WA1/ CIP1(p21)基因的表達，明確小激活RNA(saRNA)轉染胃癌細胞SGC-7901和M-28的最佳條件乃至發(fā)揮激活/上調作用的必要因素，研究其對靶細胞中的特定基因啟動子的影響，進一步明確RNAa對惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學行為的影響，為胃癌的基因治療提供必要的理論依據。
　　在前期的相關研究中，本課題組的實驗人員已經驗證了saRNA（dsP21-322）在體外

6、培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901和M-28中的生物學作用。為進一步研究其作用機制，我們選取了由本課題組首次發(fā)現的抑癌基因VEZT為小激活RNA(saRNA)的靶基因。VEZT基因是近年新發(fā)現的與胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關的抑癌基因。VEZT-在染色體的位置是12q22，具有12個外顯子和11個內含子，編碼的是一種由相連的三個組份組成的跨膜蛋白。VEZT蛋白主要包括三部分:短的細胞外區(qū)域，跨膜區(qū)域和長的細胞內區(qū)域，其中細胞外區(qū)域結合肌球蛋白ⅦA

7、(myosinⅦA)。前期的相關實驗結果證明，上調胃SGC-7901和M-28細胞中VEZT的表達可以抑制胃SGC-7901和M-28細胞的生長、侵襲和遷移;VEZT的表達受啟動子區(qū)特定部位的甲基化的影響，此外某一些非編碼的由22個核苷酸組成的單鏈microRNA也能夠影響VEZT的表達，而這種影響因素又和saRNA及RNAa上調目的基因的機制密切相關。因此為進一步證實saRNA的激活效應，以及探索saRNA的設計原則和作用機制，本研究

8、針對VEZT的肩動子序列，通過生物學軟件設計了幾條saRNA。隨后通過Western Blot以及qRT-PCR篩選出能夠顯著提高VEZT蛋白和mRNA的含量的saRNA序列，然后以篩選出的saRNA轉染胃癌細胞，進行相關實驗。同時，構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體加以轉染，以排除saRNA的脫靶效應，從而進一步明確saRNA的靶向效應對胃癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響。
　　方法:
　　通過查找相關文獻獲取

9、針對p21WAF1/ C1P1(p21)基因的有效saRNA序列，即dsP21-322，以及dsControl（陰性對照序列）并加以合成。將不同濃度的dsP21-322轉染胃癌細胞SGC-7901和M-28中。通過Western Blot篩選最合適的轉染濃度。然后用選定的dsP21-322濃度處理SGC-7901和M-28細胞，處理時間長短各不相同。通過Western Blot篩選最合適的作用時間。按照上述篩選出的saRNA最佳作用濃度

10、和時間，將dsP21-322、陰性對照序列(dsControl)均分別轉入人胃SGC-7901和M-28細胞，即dsP21-322轉染的SGC-7901和M-28作為實驗組，dsControl轉染的SGC-7901和M-28起陰性對照的作用，即dsControl組，用不含任何RNA序列的轉染試劑Lipo2000處理目的細胞作為空白對照組，Mock組。通過CCK-8實驗，觀察并評估saRNA對胃SGC-7901和M-28細胞增殖能力的影響

11、;通過Transwell assay觀察并評估dsP21-322對胃SGC-7901和M-28細胞侵襲和遷移能力的影響，
　　通過生物學軟件設計針對胃癌細胞中抑癌基因VEZT的saRNA、dsControl序列，并加以合成。將合成好的saRNA分別轉入胃癌細胞系SGC-7901和M-28中，通過Western Blot以及qRT-PCR檢測VEZT蛋白和mRNA的含量，進而篩選出有效的saRNA。隨后篩選出的有效saRNA被轉入人

12、胃SGC7901和M-28細胞，將同時轉有shRNA和篩選出的saRNA的SGC-7901、 M-28細胞，也就是saRNA-shRNA組，作為陰性對照，以排除saRNA的脫靶效應，shRNA表達載體是帶有熒光標記的pGPU6/GFP/Neo-shRNA。通過CCK-8實驗以及Transwell assay實驗評估篩選出的saRNA對SGC-7901和M-28惡性行為的影響。
　　結果:
　　1.dsP21-322能有效上調

13、人胃癌細胞SGC-7901和M-28 p21WAF1/CIP1(p21)基因表達，這種激活目的細胞的特定基因的行為具有時間劑量依賴性。
　　2.dsP21322的激活效應在轉染濃度為50nM，作用時間為72h時激活效應的綜合效果最好。
　　3.dsP21-322能夠通過上調SGC-7901和M-28細胞p21WAF1/ CIP1(p21)mRNA及蛋白質的含量，抑制靶細胞的惡性行為。
　　4.dsVEZT-94，能通過

14、上調人胃癌細胞SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質的含量，進而抑制靶細胞的惡性行為。
　　結論:
　　在本研究中，我們發(fā)現dsP21-322(saRNA)能夠有效上調p21WAF1/ CIP1(p21)基因的表達，提高p21WAF1/CIP1(p21)蛋白及mRNA的含量，進而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。此外，這種激活效應具有時間劑量依賴性，在saRNA轉染濃度為50nM，轉染時間為72h時，激活效應激

15、活效應的綜合效果最好。dsVEZT-94，能通過上調體外培養(yǎng)的靶細胞系SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質的含量，進而抑制靶細胞的惡性行為。本研究中這種生物學惡性行為豐要包括增殖、侵襲和遷移。
　　saRNA通過作用于抑癌基因啟動子的特定序列，上調或激活靶基因的表達，從而實現抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移等惡性行為的目的，研究saRNA和RNAa的作用機制，能夠為胃癌甚至其他惡性腫瘤的預防或者是治療提供切實可行的