Anxall調(diào)控小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞惡性行為及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移和耐藥性是影響肝癌患者預(yù)后和生存的重要因素，其相應(yīng)機(jī)制的研究可為其臨床診斷和治療提供依據(jù)。膜聯(lián)蛋白A11(AnnexinA11，Anxa11)為膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白。研究表明Anxa11表達(dá)失調(diào)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變、耐藥性及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制不清。本課題組前期采用Western blot對(duì)來(lái)源于同一親本、遺傳背景相同但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株Hca-P（淋

2、巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25％）和Hca-F（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75％）的研究發(fā)現(xiàn)，Anxa11在Hca-P的表達(dá)約為其在Hca-F中的2倍(P＜0.01)，提示Anxa11可能是潛在的抑制小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的蛋白。
　　目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hca-P，篩選獲得Anxa11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P單克隆細(xì)胞株;2、研究Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P體外凋亡、遷移、侵襲、粘附及耐藥性的

3、影響;3、探究Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的影響;4、探討Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P中轉(zhuǎn)錄分子c-Jun蛋白以及其磷酸化水平在藥物作用前后的變化。
　　方法:1、按Anxa11的mRNA序列，設(shè)計(jì)Anxa11的shRNAs以及無(wú)關(guān)序列作為陰性對(duì)照;2、構(gòu)建含干擾序列的pGPU6/GFP/Neo表達(dá)載體，利用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和序列測(cè)定驗(yàn)證構(gòu)建載體的正確性;3、利用梭華-Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建好的pGPU

4、6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表達(dá)載體及無(wú)關(guān)序列表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-negative control分別轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞，采用G418篩選及有限稀釋法獲得相應(yīng)的單克隆細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot檢測(cè)Anxa11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株;4、Transwell小室法和淋巴結(jié)原位雜交法檢測(cè)Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞體外遷移、侵襲和粘附能力的影響;5

5、、小鼠足墊皮下注射法分析Anxa11下調(diào)后Hca-P細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況;6、Westernblot分析Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P中相關(guān)凋亡分子表達(dá)影響;7、CCK-8法及Hoechst33258試劑盒檢測(cè)Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞耐藥性及抗5-FU誘導(dǎo)凋亡的影響;8、Western blot檢測(cè)Anxa11下調(diào)對(duì)Hca-P細(xì)胞在不同濃度5-FU作用后c-Jun的表達(dá)變化和磷酸化水平。
　　結(jié)果:1、pGPU6/GFP/Ne

6、o-shRNA-Anxa11和negative control表達(dá)載體構(gòu)建成功;2、篩選獲得Anxa11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株P(guān)-1，與無(wú)關(guān)序列單克隆細(xì)胞株P(guān)-nc相比，Anxa11在mRNA和蛋白水平分別下調(diào)82.49％和80.53％;3、相比P-nc細(xì)胞，P-1細(xì)胞的體外遷移、侵襲和淋巴結(jié)粘附能力分別提高了約1.55、1.20和1.13(1.35)倍;4、P-1細(xì)胞體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力明顯高于P-nc細(xì)胞;5、Anxa11下調(diào)對(duì)H

7、ca-P細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著性影響，但促進(jìn)Hca-P細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá);6、與P-nc細(xì)胞比較，P-1細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)有明顯的耐藥性，但對(duì)順鉑(cisplatin)并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的耐藥性;7、無(wú)5-FU作用下，與P-nc細(xì)胞比較，P-1細(xì)胞中pSer73-c-Jun磷酸化水平升高，而c-Jun蛋白及pSer73-c-Jun磷酸化水平上調(diào)為5-FU劑量依賴性。
　　結(jié)論:1、成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-

8、shRNA-1、2和negative control重組表達(dá)載體;2、篩選獲得Anxa11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株;3、Anxa11下調(diào)促進(jìn)Hca-P細(xì)胞的體外遷移、侵襲和淋巴結(jié)粘附能力;4、Anxa11下調(diào)促進(jìn)Hca-P細(xì)胞體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力;5、Anxa11下調(diào)促進(jìn)Hca-P細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá);6、Anxa11下調(diào)增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性;6、Anxa11下調(diào)可通過(guò)影響c-Jun表達(dá)及其磷酸化形式來(lái)調(diào)控鼠肝