CRKⅡ?qū)π∈蟾伟〩ca-P細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響.pdf

1、背景:肝癌是常見惡性腫瘤之一，具有高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等惡性特征。到目前為止，有效的肝癌治療手段依舊缺乏。淋巴道轉(zhuǎn)移(LNM)不僅是腫瘤轉(zhuǎn)移主要方式，且是惡性腫瘤早期主要轉(zhuǎn)移方式。淋巴道轉(zhuǎn)移與腫瘤患者預(yù)后不良密切相關(guān)。小鼠肝癌Hca-P是大連醫(yī)科大學(xué)自主從肝癌細(xì)胞克隆中分離出的亞克隆，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為25％，轉(zhuǎn)移能力較低，且只轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)而非其他器官。因此，Hca-P細(xì)胞株是研究肝癌早期淋巴道轉(zhuǎn)移的理想模型。
　　CRK(C

2、T10 regulator of kinase)家族最初作為致癌基因v-Crk產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor10)中。CRK家族包括三個成員:CRKⅠ/Ⅱ和CRKL，前兩者為相同mRNA通過選擇性剪接產(chǎn)生;CRKL則由不同的基因編碼，其結(jié)構(gòu)與CRKⅡ相似。CRK本身不具備酶活性，通過SH2和SH3結(jié)構(gòu)域作用于不同蛋白，使不能直接相互作用的信號分子發(fā)生關(guān)聯(lián)，而廣泛參與細(xì)胞內(nèi)不同信號途徑。CRKⅡ為CRK家族一員

3、，與人類多種腫瘤相關(guān)，但其與肝癌的關(guān)系少有報道，與淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系研究未見報道。
　　目的:1.構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CRKⅡ干擾質(zhì)粒，穩(wěn)轉(zhuǎn)至Hca-P，獲得CRKⅡ穩(wěn)定下調(diào)單克隆細(xì)胞株;2.檢測CRKⅡ下調(diào)對Hca-P體外增殖、克隆形成、遷移、侵襲及淋巴結(jié)黏附能力影響;3.構(gòu)建pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ真核表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染至Hca-P，在Hca-P中過表達(dá)CRKⅡ;4.檢測CRKⅡ上調(diào)對Hc

4、a-P體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力影響;5.檢測Hca-P中CRKⅡ表達(dá)變化對p130cas/CRK/Dock180/Rac1信號通路的影響。
　　方法:1.根據(jù)CrkⅡS H3C堿基序列，設(shè)計特異性shRNA及無關(guān)序列(NC)，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CRKⅡ及-NC表達(dá)載體;利用Lipofectamine(R)2000法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，G418篩選及有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株;Western blot方法檢

5、測下調(diào)率。2.根據(jù)CrkⅡCDs，設(shè)計特異性引物;PCR擴(kuò)增獲得小鼠CrkⅡ的CDs全長，產(chǎn)物純化后與pEASY-blunt simple克隆載體進(jìn)行連接，獲得pEASY-bluntsimple-CRKⅡ，進(jìn)行單雙酶切及測序鑒定;將原核克隆質(zhì)粒、pcDNA3.1/V5-HisB空質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，純化目的片段并連接，獲得pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶切及測序鑒定。3.鑒定正確的pcDNA3.1/V5-H

6、isB-CRKⅡ瞬時轉(zhuǎn)染Hca-P，Western blot檢測上調(diào)率。4.臺盼藍(lán)計數(shù)法檢測CRKⅡ下調(diào)對Hca-P增殖能力影響;CCK-8檢測CRKⅡ上調(diào)對Hca-P增殖能力影響。5.軟瓊脂克隆形成法檢測CRKⅡ上/下調(diào)對Hca-P克隆形成能力影響。6.Transwell小室法檢測CRKⅡ上/下調(diào)對Hca-P體外遷移和侵襲能力影響。7.淋巴結(jié)黏附實驗檢測CRKⅡ下調(diào)對Hca-P黏附能力影響。8.檢測在Hca-P細(xì)胞中CRKⅡ表達(dá)量水平

7、變化對p130cas/CRK/Dock180/Rac1信號，通路分子蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:1.獲得CRKⅡ下調(diào)shCRKⅡ-894-Hca-P和shCRKⅡ-852-Hca-P及陰性對照shCRKⅡ-NC-Hca-P，shCRKⅡ-894-Hca-P和shCRKⅡ-852-Hca-P下調(diào)率為52％和42％;2.pEASY-blunt simple-CRKⅡ克隆和pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;

8、3.相比shCRKⅡ-NC-Hca-P，shCRKⅡ-894-Hca-P在48、72、96h，shCRKⅡ-852-Hca-P在72、96h增殖力明顯降低;shCRKⅡ-894-Hca-P克隆形成、遷移侵襲、淋巴結(jié)粘附能力降低76.1％、71.2％、79.9％、71.1％；shCRKⅡ-852-Hca-P克隆形成、遷移侵襲、淋巴結(jié)粘附能力降低74.6％、71.4％、80.2％、55.2％;4.pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ-

9、Hca-P中 CRKⅡ水平是pcDNA3.1/V5-HisB-Hca-P的1.85倍;5.相比pcDNA3.1/V5-HisB-Hca-P，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ-Hca-P在72、96h增殖力明顯增強(qiáng)，克隆形成、遷移侵襲分別增高1.71、1.79、1.56倍;6.CRKⅡ上下調(diào)對p130/casCRK/Dock180/Racl通路影響不明顯。
　　結(jié)論:1.獲得CRKⅡ穩(wěn)定下調(diào)單克隆shCRKⅡ-894-Hc