核蛋白PCNP對小鼠DC細(xì)胞遷移與增殖能力的影響.pdf

1、背景：PCNP（PEST-Containing Nuclear Protein）是于2002年新發(fā)現(xiàn)的一種含有PEST序列的核蛋白，它是泛素連接酶NIRF（Np95/ICBP90-like RING Figer Protein）的底物。NIRF包含類泛素化區(qū)域(a ubiquitin-like domain)，YDG/SRA區(qū)域(a YDG/SRA domain)， PHD區(qū)域(a PHD domain)和指環(huán)狀區(qū)域(a RING do

2、main)等四個區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)NIRF在正常細(xì)胞增殖期間呈現(xiàn)高表達(dá)，而在G0/G1期間呈現(xiàn)低表達(dá)。核蛋白PCNP包含的PEST序列中含有豐富的脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T），是短壽命蛋白。而含有PEST序列的功能蛋白質(zhì)通常是通過水解途徑調(diào)控，且大多數(shù)是通過泛素介導(dǎo)途徑降解。NIRF本身具有泛素連接酶的特征，且其自身具有自動泛素酶的活性。泛素依賴性蛋白的降解可以調(diào)節(jié)依靠泛素化途徑的多種細(xì)胞周期的過程，目前研究證實(shí)，

3、這些過程包括細(xì)胞的周期進(jìn)程、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、DNA的損傷和變異。NIRF泛素連接酶與被降解蛋白質(zhì)的特異性底物 PCNP結(jié)合，進(jìn)而影響泛素化反應(yīng)的功能與效率。例如核蛋白PCNP在293T細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中是很容易被泛素化，在體內(nèi)或體外NIRF都能夠把PCNP泛素化。這說明NIRF與PCNP信號軸可能通過對細(xì)胞周期的調(diào)控而對細(xì)胞增殖發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。同時研究表明，在很多腫瘤細(xì)胞基因中NIRF在9p23-24.1段基因出現(xiàn)的頻繁明顯高于正

4、常細(xì)胞，推測PCNP和NIRF可能也與腫瘤發(fā)生有一定的關(guān)系。樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells DC）是目前確定的唯一能激活初始T細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞，能高效地?cái)z取加工、處理、遞呈抗原，DC數(shù)量極少，僅占單核細(xì)胞的1％，未成熟遷移能力強(qiáng)。微量的LPS就能刺激DC合成與釋放細(xì)胞因子（TNF-α）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小鼠脾臟中CD8α+DC細(xì)胞中PCNP的mRNA水平高表達(dá)。前期結(jié)果顯示沉默PCNP能抑制DC增殖。目前在DC細(xì)

5、胞中對PCNP的研究尚未報(bào)道。本課題初步探討了核蛋白PCNP在DCs中的作用及其分子機(jī)制。
　　目的：⑴探索PCNP過表達(dá)和沉默對DC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。⑵探討LPS和蛋白酶體抑制劑“MG-132”對PCNP過表達(dá)和沉默后的DC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法：①DC2.4細(xì)胞對照（未處理）組：用流式細(xì)胞儀，檢測DC-PCNP-Flag、DC-sh-PCNP及其相應(yīng)對照組穩(wěn)定株的表面分子MHC II及共刺激分子CD80、C

6、D86的表達(dá)。用Transwell小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，研究PCNP過表達(dá)與沉默后對DC細(xì)胞遷移的影響。用平板克隆實(shí)驗(yàn)，研究PCNP沉默和過表達(dá)后對DC細(xì)胞克隆形成能力的影響。②實(shí)驗(yàn)組：在DC2.4細(xì)胞中分別加入LPS和蛋白酶體抑制劑（MG-132）；檢測對DC細(xì)胞形態(tài)、遷移、克隆形成能力的影響。
　　結(jié)果：⑴成功建立PCNP-Flag及PCNP-EGFP過表達(dá)穩(wěn)定株。⑵成功篩選得到過表達(dá)穩(wěn)定株DC-Flag（對照組）、DC-PCN

7、P-Flag、DC-EGFP（對照組）、DC-PCNP-EGFP；沉默穩(wěn)定株DC-RNAi-NC（Negative Control NC）和DC-sh-PCNP穩(wěn)定株。⑶DC-PCNP-Flag穩(wěn)定株與對照組相比，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；DC-sh-PCNP穩(wěn)定株與對照組相比，細(xì)胞形態(tài)也無明顯變化。⑷經(jīng)流式檢測，DC-PCNP-Flag穩(wěn)定株與對照組相比，其表面分子MHC II和共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而DC-s

8、h-PCNP穩(wěn)定株與對照組相比，其表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其各自的表面分子MHC II均無明顯變化。⑸經(jīng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞劃痕和 Transwell小室實(shí)驗(yàn)）發(fā)現(xiàn) PCNP過表達(dá)組（DC-PCNP-Flag）DC2.4穩(wěn)定株與對照組細(xì)胞相比，其遷移能力下降（P﹤0.05），而PCNP沉默組（DC-sh-PCNP）穩(wěn)定株與對照組相比，其遷移能力增強(qiáng)（P﹤0.01）。⑹平板克隆實(shí)驗(yàn)，證明PCNP沉默后在DC

9、細(xì)胞中抑制克隆形成能力（P﹤0.05），而PCNP過表達(dá)后能促進(jìn)DC細(xì)胞的克隆形成能力（P﹤0.01）。⑺加入LPS后，DC細(xì)胞PCNP的沉默組與過表達(dá)組均促進(jìn)DC的遷移能力，而兩組間相比無差異（P﹥0.05）；加入MG-132后，DC細(xì)胞PCNP的沉默組與過表達(dá)組均抑制 DC的遷移能力，而兩組間相比也無差異（P﹥0.05）；而 LPS和 MG-132對 DC細(xì)胞的遷移能力的作用相反（P﹤0.01）。⑻加入LPS后，DC細(xì)胞PCNP的沉

10、默組與過表達(dá)組均促進(jìn)DC的克隆形成能力，而兩組間相比無差異（P﹥0.05）；加入MG-132后，在DC細(xì)胞PCNP沉默組與過表達(dá)組均抑制DC的克隆形成能力，而兩組間相比也無差異（P﹥0.05）；而LPS和MG-132對DC細(xì)胞的克隆形成能力的作用相反（P﹤0.01）。
　　結(jié)論：①DC未成熟時（沒有LPS刺激時），PCNP對 DC2.4細(xì)胞的形態(tài)、表面分子、均無影響，但能夠抑制DC2.4細(xì)胞的遷移能力，提高DC2.4細(xì)胞的克隆形成