遷移侵襲抑制蛋白在腎癌中的表達(dá)及對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響研究.pdf

1、研究背景：
　　腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, R C C)是腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤病變，其病理類型多樣，除80％-90%的透明細(xì)胞癌外還有腺癌、嫌色細(xì)胞癌等類型。近年調(diào)查顯示，國內(nèi)腎癌發(fā)病率約占全身惡性腫瘤2%-3%，在泌尿系統(tǒng)中的比率僅次于位居榜首的膀胱癌。相當(dāng)數(shù)量以“血尿、疼痛、腫塊”三聯(lián)癥就診的患者已經(jīng)處于中晚期。腎癌因病理類型的特殊性使其對(duì)放化療敏感性差，目前臨床常規(guī)以外科手術(shù)作為主要治療方法，靶

2、向藥物輔助治療，但對(duì)于術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤、轉(zhuǎn)移等進(jìn)展事件無有效預(yù)防辦法，對(duì)于部分喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的T3期病變以及T4期病變尚無有效治療手段。近年發(fā)現(xiàn)的遷移侵襲抑制蛋白（migration and invasion inhibitory protein, MIIP,亦稱ID M5)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤轉(zhuǎn)移的能力。當(dāng)其位于染色體lp36.22的編碼基因發(fā)生等位基因缺失或基因單倍劑量不足時(shí)，可誘發(fā)全身多系統(tǒng)惡性腫瘤，如前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤

3、、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等。并且國外研究表明該基因是腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)信號(hào)通路的上游調(diào)控基因，增加M IIP表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。但到目前為止尚無腎癌的相關(guān)報(bào)道。
　　目的：
　　1.明確腎細(xì)胞癌組織及癌旁正常腎組織中M IIP蛋白的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌的發(fā)生及臨床分期之間的關(guān)系。
　　2.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)制備過表達(dá)M IIP蛋白的腎癌786-0/MIIP細(xì)胞系

4、，通過上調(diào)腎癌786-0細(xì)胞中M I I P表達(dá)量觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。
　　方法：
　　1.不同病理組織中m iip蛋白表達(dá)水平檢測
　　采用免疫組織化學(xué)染色（S P)法對(duì)84對(duì)腎細(xì)胞癌患者手術(shù)標(biāo)本（配對(duì)腎癌組織組、癌旁正常腎組織組）進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察組織切片染色情況，運(yùn)用半定量法分析腎細(xì)胞癌組織及癌旁正常腎組織中M IIP蛋白的表達(dá)情況，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析M IIP表達(dá)水平與腎癌的發(fā)生及臨床分

5、期的關(guān)系。同時(shí)提取患者腎癌組織及癌旁正常腎組織蛋白，通過Westem-blot檢測腎細(xì)胞癌組織與癌旁正常腎組織中M I I P蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行表達(dá)差異性分析。
　　2. M IIP對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響研究
　　構(gòu)建攜帶M I I P基因的P-Flag-CMV4質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染腎癌786-0細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)組786-0/MIIP細(xì)胞系，P-Flag-CMV4空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞制備對(duì)照組786-0

6、/CMV4細(xì)胞系，未做轉(zhuǎn)染處理的786-0細(xì)胞系作為空白組。Westem-blot、Real-time P C R技術(shù)檢測三組細(xì)胞M I I P蛋白和信使RNA(messenger R N A, m R N A)的表達(dá)情況。通過細(xì)胞周期測定（流式細(xì)胞術(shù))、MTT實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖能力， Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1.不同病理組織中miip蛋白表達(dá)水平檢測
　　運(yùn)用

7、SP法檢測發(fā)現(xiàn)：腎細(xì)胞癌組織MIIP蛋白染色陽性比率為30.95%，癌旁正常腎組織M IIP蛋白染色陽性比率為85.71%(P<0.05)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腎細(xì)胞癌不同臨床分期中M I I P蛋白染色陽性比率分別為I期54.55%， II期40.54%和III期13.89%;根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：I期和I I期比較P>0.25，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；I期與III期比較，P<0.00625,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；II期與III期比較，P<0.0125，具

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　Westem-blot檢測結(jié)果分析：腎細(xì)胞癌組織中M I I P條帶灰度值較癌旁正常腎組織的灰度值低，經(jīng)/檢驗(yàn)，P<0.01。這與免疫組織SP法結(jié)果相符合。
　　2. M IIP對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響研究
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期顯示：實(shí)驗(yàn)組786-0/MIIP細(xì)胞系增殖指數(shù)PI:53.69,小于空白組786-0細(xì)胞系（PI:56.33) CP<0.05)，說明上調(diào)M IIP表達(dá)后細(xì)胞

9、周期受到阻滯。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:上調(diào)M IIP表達(dá)后細(xì)胞增殖能力減弱(i^O.OlXTranswell實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組786-0/MIIP細(xì)胞穿透小室數(shù)為（15.23士3.21)，少于對(duì)照組（39.03±7.49)及空白組（40.17±4.24)( P<0.01),說明上調(diào)M I I P表達(dá)后786-0細(xì)胞侵襲能力減弱。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)M I I P表達(dá)后786-0細(xì)胞遷移能力弱于對(duì)照組及空白組(P<0.01) o
　　結(jié)論