著絲粒蛋白H在腎癌中的表達和對腎癌進展的影響.pdf

1、腎細胞癌，即腎癌，是一種常見的泌尿系惡性腫瘤，因此，深入研究和探討與腎癌發(fā)生發(fā)展密切相關的基因，對加強和促進腎癌的防治工作具有重要意義。
　　著絲粒復合體作為有絲分裂過程中形成的重要細胞結(jié)構(gòu)成分，其參與和調(diào)控細胞有絲分裂，使其正常精細的進行，著絲粒蛋白功能失調(diào)會導致CIN和異倍體細胞的形成。著絲粒蛋白是一個裝配在染色體DNA上的一個大型多蛋白復合體。它給紡錘絲牽拉染色體提供附著點?，F(xiàn)已有百種以上著絲粒蛋白家族成員被相繼發(fā)現(xiàn)。它們在

2、腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也愈受重視。一些著絲粒蛋白家族的常見成員，如CENPA、CENPF、CENPH和INCENP等被發(fā)現(xiàn)和多種腫瘤的病理生理過程密切相關。盡管它們在腎癌中也表現(xiàn)出表達的異常，但其在腎癌中的作用我們得知尚少。
　　著絲粒蛋白H(centromere protein H，CENPH)作為著絲粒蛋白家族的重要一員，是活性著絲粒復合體的重要組成成分，對細胞有絲分裂的準確進行有重要的調(diào)控作用。近年來著絲粒蛋白家族在腫瘤發(fā)生發(fā)

3、展中的作用愈受重視，研究顯示CENPH在多種惡性腫瘤表達異常增高，且和患者的預后相關，但由于腫瘤的異質(zhì)性，CENPH在腎癌中是否發(fā)揮核心調(diào)控作用，尚不得為知。本論文旨在研究CENPH對腎癌發(fā)生發(fā)展的影響探討其可能的影響機制。
　　本項研究分為三大部分。第一部分通過分析團隊前期進行的腎癌轉(zhuǎn)錄組測序項目的腎癌與癌旁組織的差異表達基因數(shù)據(jù)，分析包括CENPH在內(nèi)的多種著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織中的表達情況。第二部分用qRT-PCR和免

4、疫組織化學技術對CENPH在腎癌中的表達情況進行驗證，并進一步研究其與腎癌臨床病理學特征之間的關系，探討其作為腎癌診斷及預后指標的可能性。第三部分通過檢測CENPH在四種腎癌細胞株中的表達情況，建立腎癌CENPH沉默干擾模型，研究CENPH對腎癌細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響，并探討其可能的作用機制。
　　第一部分：腎癌轉(zhuǎn)錄組測序揭示著絲粒蛋白H在腎癌組織中高表達
　　目的:
　　1.轉(zhuǎn)錄組測序揭示腎癌組織與癌旁正常

5、腎組織的基因表達差異譜
　　2.分析著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織與癌旁正常組織表達的差異性
　　3.分析CENPH在腎癌及其他腫瘤組織中的表達情況
　　方法:
　　1.使用Illumina HiSeqTM2000測序平臺對34對腎癌及癌旁正常組織進行轉(zhuǎn)錄組測序;
　　2.對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、比對、篩選，進行GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析，找出差異基因表達譜;
　　3.在已得到數(shù)據(jù)

6、中分析著絲粒蛋白家族成員的表達差異情況;
　　4.檢索轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及芯片數(shù)據(jù)，分析CENPH在腎癌中的表達特性。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)錄組測序得出豐富的腎癌與癌旁組織基因表達差異譜
　　通過以上34對腎癌及癌旁組織RNA-Seq測序，分析結(jié)果包括含20453個基因的mRNA相對表達量（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。
　　2.多種著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織中高表達
　　在測序結(jié)果中分析著絲粒蛋白家族的表達情況。最終測

7、序結(jié)果包括20個著絲粒蛋白基因(CENPQ、CENPJ、CENPL、CENPV、CENPB、CENPI、CENPK、CENPE、CENPP、CENPW、CENPA、CENPN、INCENP、CENPT、CENPH、CENPO、CENPBD1、CENPM、CENPF、CENPC1)的表達情況。多數(shù)基因在腎癌組織中呈高表達，其中以CENPH高表最為明顯。
　　3.CENPH在包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達增高
　　CENPH在

8、所有的34對腎癌配對樣本中表現(xiàn)為高表達，檢索GENT芯片數(shù)據(jù)庫顯示CENPH在包括腎癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)錄組測序揭示多種著絲粒蛋白在腎癌組織中表達上調(diào)，其中以CENPH的高表最為明顯，其表達異?？赡芘c腎癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。
　　第二部分：著絲粒蛋白H在腎癌組織中的表達特征及與患者預后的關系
　　目的:
　　1.檢測腎癌組織中CENPH mRNA和蛋白的表達情況
　

9、　2.分析CENPH蛋白的表達水平與腎癌患者臨床病理因素之間的關系
　　3.分析CENPH蛋白的表達水平與腎癌患者預后的相關性，探討CENPH作為腎癌分子標志物的可能性。
　　方法:
　　1.用qRT-PCR方法檢測21對腎癌組織和癌旁正常腎組織中CENPH mRNA的表達水平;
　　2.通過免疫組織化學的方法在腎癌組織及癌旁正常腎組織石蠟包埋標本中檢測CENPH蛋白的表達水平;
　　3.使用SPSS20軟

10、件，采用x2檢驗分析CENPH蛋白表達強弱與腎癌患者臨床病理因素之間的關系;
　　4.采用Kaplan-Meier法、Log-Rank檢驗和Cox比例風險模型分析CENPH蛋白表達水平對腎癌患者生存預后的影響。
　　結(jié)果:
　　1.腎癌組織中CENPH的表達顯著高于癌旁正常腎組織
　　在21個腎癌患者的癌組織及對應的癌旁正常腎皮質(zhì)組織中檢測CENPH mRNA的表達情況，qRT-PCR的檢測結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相

11、一致，顯示CENPH在腎癌組織中高表達。
　　2.CENPH蛋白的表達水平與腎癌患者的臨床病理因素相關
　　在109例腎癌標本中，79.8％(87/109)的腎癌組織為CENPH陽性表達，而在癌旁正常腎皮質(zhì)組織中，僅22.0％(24/109)表現(xiàn)為CENPH陽性表達。CENPH主要定位于細胞核，部分患者胞漿也有輕微染色。進一步分析發(fā)現(xiàn)CENPH表達與患者的腫瘤Fuhrman分級(P=0.001)、遠處轉(zhuǎn)移(P=0.024)及

12、臨床分期(P=0.014)密切相關，未見其與患者性別、年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。
　　3.CENPH的表達水平與腎癌患者的生存預后相關
　　在109例臨床腎癌標本中，CENPH高表達的患者總生存時間較CENPH低表達的患者明顯縮短（Log-Rank檢驗，P=0.002）。Cox回歸模型分析表明，CENPH蛋白表達水平和臨床分期是腎癌患者生存的獨立預測因素。
　　結(jié)論:
　　1.CENPH在腎癌組織中高表達;

13、
　　2.CENPH有可能成為一種新的腎癌預后標志物。
　　第三部分：著絲粒蛋白H對腎癌細胞生物學行為的影響及相關作用機制
　　目的:
　　1.研究CENPH表達水平對腎癌細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響
　　2.探討CENPH調(diào)節(jié)腎癌細胞增殖及凋亡的相關機制
　　方法:
　　1.采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測四種腎癌細胞株和一種腎小管上皮細胞株中CENPH的表達情

14、況;
　　2.采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染技術建立CENPH沉默干擾的腎癌細胞株模型;
　　3.通過CCK-8、平板克隆實驗、流式AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測等實驗觀察CENPH對腎癌細胞增殖、凋亡等細胞生物學行為的影響;
　　4.使用Western blotting檢測腎癌細胞經(jīng)CENPH siRNA轉(zhuǎn)染后，相關增殖、凋亡標志蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CENPH在腎癌細胞株中呈高表達

15、>　　我們檢測四種腎癌細胞株和一種腎小管上皮細胞株中CENPH mRNA和蛋白的表達水平。和腎小管上皮細胞株HK-2相比，三種腎癌細胞株(ACHN，786-0和A704)中CENPH高表達（P＜0.05），而僅在細胞株A498中未見CENPH高表達。
　　2.下調(diào)腎癌細胞中CENPH的表達水平導致細胞增殖能力的降低
　　在相對高表達CENPH的腎癌細胞株ACHN和786-0中轉(zhuǎn)入CENPH siRNA干擾沉默CENPH，建立

16、CENPH低表腎癌細胞模型，檢測細胞體外生長活力、克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)干擾沉默CENPH能降低腎癌細胞的體外增殖能力。
　　3.CENPH調(diào)節(jié)腎癌細胞的凋亡
　　腎癌細胞株ACHN和786-0分別轉(zhuǎn)染CENPH siRNA降低CENPH的表達，兩天后使用annexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。流式細胞學結(jié)果顯示降低表達CENPH能增加腎癌細胞的凋亡水平。
　　4.CENPH影響Ki-67和Survivin的表

17、達
　　使用Western blotting方法檢測增殖和凋亡的分子標志物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-CENPH可抑制腎癌細胞中增殖蛋白Ki-67和細胞凋亡抑制蛋白Survivin的表達。
　　結(jié)論:
　　1.CENPH在多數(shù)腎癌細胞株中高表達;
　　2.敲低腎癌細胞中的CENPH表達可以抑制細胞增殖活力，增加細胞凋亡的比例;
　　3.CENPH對腎癌細胞生物學行為的影響可能是通過影響Survivin蛋白的表達而發(fā)揮作