hepaCAM在腎癌中表達(dá)及對腎癌細(xì)胞侵襲力的影響.pdf

1、第一部分 目的：探討肝細(xì)胞粘附分子（hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM）在腎癌中的表達(dá)及臨床意義。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法檢測6例正常腎組織和30對腎癌及相應(yīng)的癌旁組織中hepaCAMmRNA表達(dá)，分析其與腎臟病理學(xué)特征的關(guān)系。 結(jié)果：hepaCAMmRNA在6例正常腎組織均呈現(xiàn)高表達(dá)；而在30例癌組織中hepaCAM的表達(dá)顯著低于癌旁組織（P<

2、0.01），且其表達(dá)和腎癌分級、分期無顯著相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論：hepaCAM基因在正常腎臟組織中高表達(dá)，在腎癌組織中呈低表達(dá)（或不表達(dá)），且不能用于評價腎癌的分級分期。 第二部分 目的：hepaCAM基因真核表達(dá)載體pEGFPN2/hepaCAM及空載體pEGFPN2的鑒定，觀察轉(zhuǎn)染后hepaCAM在786-0細(xì)胞中定位，獲得穩(wěn)定表達(dá)hepaCAM的786-0細(xì)胞株。 方法：將攜有hepaCA

3、M基因的重組真核表達(dá)載體pEGFPN2/hepaCAM經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切及序列鑒定，轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞株，熒光顯微鏡計(jì)算脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率并觀察hepaCAM蛋白786-0細(xì)胞的定位。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞，RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：獲得含有hepaCAM基因的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定、高效轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞的方法。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染時間為48h，最合適質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為

4、1：2。熒光顯微鏡顯示：hepaCAM主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周區(qū)域及突起表面，呈現(xiàn)典型細(xì)胞粘附分子特性。篩選出穩(wěn)定表達(dá)hepaCAM的786-0細(xì)胞，檢測到高表達(dá)的hepaCAM基因。 結(jié)論：重組質(zhì)粒能夠有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究hepaCAM在RCC細(xì)胞中侵襲活性奠定了基礎(chǔ)。 第三部分 目的：探討hepaCAM基因?qū)雽δI癌細(xì)胞侵襲活性的影響。 方法：MTT法及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察其

5、對腎癌細(xì)胞生長抑制作用；RT-PCR方法檢測MMP2和MMP9mRNA的表達(dá)，明膠酶譜法檢測MMP2和MMP9活性的變化，Transwell小室法檢測786-0細(xì)胞的體外侵襲能力。 結(jié)果：MTT顯示hepaCAM基因抑制細(xì)胞成活率在4、5、6天分別為26.5％、38.1％、35.7％（P<0.01）；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)hepaCAM基因轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞后，細(xì)胞克隆數(shù)減少5倍；MMP2及MMP9mRNA表達(dá)和酶活性明顯受抑制（P