MicroRNA-30a-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝細(xì)胞肝癌（hepataocellular carcinoma, HCC）是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、預(yù)后差、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)。深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，試圖為肝癌的診治提供新的思路。
　　MicroRNA(miRNA)是一類大小約為19-25bp的非編碼單鏈小分子RNA，在不破壞mRNA穩(wěn)定性的前提下通過(guò)與靶標(biāo)基因mRNA3'UTR完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而抑制或阻斷靶基因翻譯。mi

2、RNA具有高度時(shí)序性、保守性、組織特異性的特點(diǎn)，單一miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)也可能一個(gè)靶基因受到多個(gè)miRNA的調(diào)控。通過(guò)大量肝癌組織與正常肝組織miRNA表達(dá)譜的比較發(fā)現(xiàn)，其中有一部分miRNA表達(dá)上調(diào)，有一部分表達(dá)下調(diào)，上調(diào)的miRNA可能起著促癌基因的作用，而表達(dá)下調(diào)的miRNA則可能起著抑癌基因的作用。
　　篩查肝癌患者的miRNA譜，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織對(duì)比，miRNA-30a、-30b、-30c、-30e等表達(dá)明顯

3、下調(diào)，特別是在已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中，下調(diào)更甚，這提示 miRNA-30家族表達(dá)下調(diào)與肝癌的形成可能有一定的聯(lián)系。目前 miRNA-30家族成員在肝癌中的具體作用機(jī)制研究較少。其中，家族成員之一miRNA-30a-5p在其他腫瘤中常見(jiàn)報(bào)道，因此我們挑選miRNA-30a-5p為研究對(duì)象，檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞SMCC-7721增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：
　　1.采用 RT-qPCR檢測(cè) miRNA-30a-5p

4、在肝癌組織中與正常肝組織中的表達(dá)差異；
　　2.采用 RT-qPCR檢測(cè) miRNA-30a-5p在肝癌細(xì)胞株中與正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)差異；
　　3.采用轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞株內(nèi)miRNA-30a-5p的表達(dá)水平；
　　4.采用 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-30a-5p進(jìn)行體外功能分析，觀察過(guò)表達(dá)miRNA-30a-5p后肝癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為變化；
　　5.采用裸鼠成瘤

5、實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-30a-5p進(jìn)行體內(nèi)功能分析，觀察過(guò)表達(dá)miRNA-30a-5p后肝癌細(xì)胞對(duì)裸鼠成瘤的影響；
　　6.采用生物學(xué)信息技術(shù)預(yù)測(cè) miRNA-30a-5p的靶標(biāo)基因，Western Blot技術(shù)進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)RT-qPCR分別檢測(cè)48例手術(shù)肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本及10例正常肝組織標(biāo)本中miRNA-30a-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（0.3

6、1367±0.0568)低于癌旁肝組織(0.61226±0.0954）、正常肝組織(1.0733±0.0412)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）,RT-qPCR分別檢測(cè)7種肝癌細(xì)胞株SMCC-7721、Huh7.0、HepG2、HCCLM3、HCCLM6、MHCC-97H、MHCC-97L及正常肝細(xì)胞株L02中miRNA-30a-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在7種肝癌細(xì)胞株的相對(duì)表達(dá)量均低于正常肝細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、（p<0.05）；
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p mimics入肝癌細(xì)胞株SMCC-7721細(xì)胞， CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p過(guò)表達(dá)后可以抑制SMCC-7721細(xì)胞的增殖能力（P<0.05），流式細(xì)胞術(shù)顯示 miRNA-30a-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期出現(xiàn)了 S期阻滯，Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)表明， miRNA-30a-5p過(guò)表達(dá)可以抑制SMCC-7721細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力(p<0

8、.05)；
　　3.通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察到肝癌細(xì)胞 SMCC-7721在轉(zhuǎn)染miRNA-30-5p后，裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)明顯減緩，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白組相比較，腫瘤的大小、質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miRNA-30a-5p的可能靶基因，并利用western blot技術(shù)初步驗(yàn)證了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methltransferase3A）可能是miRNA-30a-5p的靶基因。