二氫楊梅素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　肝細(xì)胞癌(HCC)以手術(shù)為主的綜合性治療已取得了明顯的療效，但術(shù)后易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因此，進(jìn)一步尋找術(shù)后化療藥物具有重要的臨床意義。二氫楊梅素(DHM)是一種從葡萄科植物提取黃酮類化合物，具有多種藥理活性。研究也發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗癌作用。本研究使用DHM體外作用于肝癌細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)肝細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，測(cè)定p53、Bax、Bak、caspase-3和caspase-9的表達(dá)變化，旨在探討DHM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋

2、亡的機(jī)制。
　　[方法]
　　1.運(yùn)用MTT檢測(cè)DHM對(duì)細(xì)胞增殖的作用。
　　2.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DHM對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　3.用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHM對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.Western bloting檢測(cè)p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9的蛋白表達(dá)變化。
　　[結(jié)果]
　　1.DHM對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響
　　1.1用0、5μmol

3、/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM處理肝癌細(xì)胞24h，HepG2的抑制率分別為（2.50±1.04）％、（3.71±0.14）％、（5.03±1.12）％、(12.25±1.09)％、(14.90±0.94)％、(19.75±2.01)％; QSG7701的抑制率分別為（4.03±0.12）％、（4.63±0.52）％、（5.03±1.12）％、（5.23±1.12

4、）％、(11.17±1.62)％、(20.08±1.09)％;QGY7701的抑制率分別為（3.83±0.22）％、(5.23±0.42)％、（9.86±1.32)％、(15.23±1.92)％、(17.17±1.62)％、（50.08±1.09)％;Hepal-6的抑制率分別為（3.73±0.52）％、（4.12±0.52）％、(9.83±1.42)％、（8.93±1.52）％、(27.17±1.32)％、(34.98±1.17)％，

5、隨著濃度的增加肝癌細(xì)胞明顯受到抑制(P＜0.01)。
　　1.2用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM處理肝癌細(xì)胞48h，HepG2的抑制率分別為（2.50±1.04）％、（3.51±0.14）％、(8.03±1.32)％、(18.25±1.39)％、(24.90±0.84)％、(33.75±2.01)％; Huh7的抑制率分別為(18.43±1.

6、42)％、（21.63±0.52）％、（25.03±1.12）％、（31.23±2.15）％、(33.17±1.62)％、(40.08±1.09)％;QGY7701的抑制率分別為（2.53±0.22）％、(2.62±0.42)％、(36.86±1.32)％、(49.23±1.52)％、(56.17±1.62)％、(62.28±1.09)％;QSG7701的抑制率分別為（7.53±0.22）％、（12.86±1.32）％、（15.23±1

7、.52）％、(19.17±1.62)％、(32.28±1.09)％、(52.62±1.42)％; Hepal-6的抑制率分別為（4.73±0.52）％、（5.12±0.52）％、（14.83±1.42）％、（18.93±1.52）％、（29.17±1.32）％、(40.98±1.17)％。上述細(xì)胞隨著濃度的增加肝癌細(xì)胞明顯受到抑制(P＜0.001)。MHcc97H的抑制率分別為(5.73±0.52)％、(7.62±0.52)％、(10.

8、83±1.42)％、(9.93±1.52)％、(12.27±1.32)％、(17.98±1.17)％; QGY7703的抑制率分別為(20.73±0.52)％、(22.62±0.52)％、(20.83±1.42)％、(24.93±1.52)％、(23.27±1.32)％、(32.98±1.17)％;SK-HEP-1的抑制率分別為（5.73±0.52）％、（6.62±0.52）％、(11.83±1.42)％、(15.93±1.52)％、(

9、17.27±1.32)％、(19.98±1.17)％。細(xì)胞隨著濃度的增加肝癌細(xì)胞受到抑制(P＜0.05)。
　　1.3用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM處理肝癌細(xì)胞72h, MHcc97L的抑制率分別為（4.73±0.52）％、(5.62±0.52)％、(12.83±1.42)％、(16.93±1.52)％、(18.27±1.32)％、(25.

10、98±1.17)％;細(xì)胞隨著濃度的增加肝癌細(xì)胞明顯受到抑制(P＜0.01)。當(dāng)DHM為150μm時(shí)，抑制率仍＜50％，可認(rèn)為這些肝癌細(xì)胞株對(duì)DHM不敏感。
　　1.4應(yīng)用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM作用24、48、72h, HL7702和L-02的抑制率無顯著差異（P＞0.05）。
　　2.DHM對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響
　　應(yīng)用0

11、、50μmol/L、100μmol/L的DHM作用后，HepG2, QGY7701, MHcc97L,Hepal-6和HL7702的G1、 G2/M、S期時(shí)間分別無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.DHM對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響
　　3.1 AnnexinⅤ法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　應(yīng)用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM處理，24h時(shí)HepG2的凋亡率分別為(5.90±1.04)％、(10.90±1.32)％、(

12、17.90±2.07)％; QGY7701的凋亡率分別為(11.03±1.08)％、(15.30±1.08)％、(25.90±2.01)％，不同濃度間比較有顯著差異(P＜0.05），48h時(shí)MHcc97L的凋亡率分別為(15.93±1.65)％、(14.17±1.07)％、(16.80±0.70)％;Hepal-6的凋亡率分別為(15.17±1.65)％、(47.67±1.72)％、(64.63±4.66)％，不同濃度間比較有顯著差異(

13、P＜0.05)。HL7702的凋亡率分別為(12.77±3.07)％、(8.03±1.21)％、(9.17±1.95)％，不同濃度間比較沒有明顯差異。
　　3.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　應(yīng)用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM處理，24h時(shí)HepG2的凋亡率分別為(1.24±0.02)％、(12.50±1.02)％、(37.90±2.27)％; QGY7701的凋亡率分別為（0.06±0.01）％、(2.

14、50±0.08)％、(14.90±1.01)％，不同濃度間比較有顯著差異(P＜0.05)，48h時(shí)MHcc97L的凋亡率分別為(1.20±0.05)％、(0.07±0.01)％、(7.90±0.70)％; Hepal-6的凋亡率分別為（0.05±0.02）％、(22.47±1.52)％、(37.23±2.65)％;HL7702的凋亡率分別為(1.27±1.07)％、(1.33±0.21)％、(1.17±1.05)％，不同濃度間比較有顯著

15、差異（P＜0.05）。
　　3.3正常肝細(xì)胞HL7702用≥50μmDHM處理后凋亡率反而下降，肝細(xì)胞有增殖現(xiàn)象，說明低濃度的DHM不會(huì)引起正常肝細(xì)胞的凋亡比較沒有顯，與對(duì)照組比較沒有顯著差異。
　　4.DHM對(duì)肝癌細(xì)胞p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9蛋白的影響
　　4.1應(yīng)用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM處理后，HepG2，QGY7701，Hepal-6的p53、Bax

16、、Bak蛋白表達(dá)隨濃度增加有明顯遞增趨勢(shì)，給藥組與對(duì)照組的灰度值相比較有明顯差異(P＜0.01)。MHcc97L的p53、Bax、Bak蛋白表達(dá)隨濃度增加有遞增趨勢(shì)，給藥組與對(duì)照組的灰度值相比較有明顯差異(P＜0.05）。
　　4.2應(yīng)用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM處理后，HepG2，QGY7701，Hepal-6、MHcc97L的caspase-3(p19)蛋白表達(dá)隨濃度增加有遞增趨勢(shì)，給藥組與對(duì)照組的灰度值

17、相比較有明顯差異(P＜0.05)，caspase-9蛋白的表達(dá)并沒有改變。
　　4.3應(yīng)用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM處理后，HL7702的p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)并沒有改變。
　　[結(jié)論]
　　1.DHM能不同程度的抑制肝癌細(xì)胞HepG2、QGY7701、Huh7、QSG7701、MHcc97L、MHcc97H、QGY7703、SK-HEP-1、He

18、pal-6的增殖，與時(shí)間和劑量成正相關(guān)。
　　2.DHM對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2，QGY7701，MHcc97L，Hepal-6和HL7702的細(xì)胞周期不產(chǎn)生影響。
　　3.DHM能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2、QGY7701、Hepal-6、MHcc97L的細(xì)胞凋亡，不能誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞的凋亡。
　　4.肝癌細(xì)胞HepG2、QGY7701、Hepal-6、MHcc97L是通過誘導(dǎo)p53的上調(diào)而增加Bax和Bak的表達(dá)，抑制