三氧化二砷聯(lián)合維生素C誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、三氧化二砷(As2O3)是中藥砒霜中的主要有效成分，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞發(fā)生凋亡，臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)經(jīng)As2O3治療的APL病人可達(dá)到完全緩解。目前As2O3已由美國FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性的APL。近年來有研究表明As2O3的促凋亡作用不僅局限于APL細(xì)胞，對一些其他類型白血病及實(shí)體瘤細(xì)胞均有促凋亡作用。 肝癌是我國常見和高發(fā)的惡性腫瘤，對常用化療藥物均不敏感。與相關(guān)研究報(bào)告一致

2、，本課題組證實(shí)As2O3能促進(jìn)體外生長的肝癌細(xì)胞株HepG2發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞增殖。鑒于As2O3的毒性和致癌性，尋找促進(jìn)其療效并降低其用量及毒性的輔助藥品顯得十分重要。有研究報(bào)道，維生素C(AA)可增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞對As2O3的敏感性。并且本課題組發(fā)現(xiàn)一定劑量AA能增加As2O3誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率，本文擬對其作用和機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。 第一部分三氧化二砷與維生素C聯(lián)用對肝癌細(xì)胞活性氧及抗氧化物質(zhì)的影響 §1三氧化二砷

3、與維生素C聯(lián)用對肝癌細(xì)胞活性氧的影響 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧探針的熒光強(qiáng)度，觀察As2O3和AA對HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響。 2.0μmol/LAs2O3、100μmol/LAA聯(lián)合作用24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高，為正常對照組1.62±0.093倍，較單用2.0μmol/LAs2O3組ROS含量(為正常對照組1.35±0.085倍)顯著升高(P＜0.05)。 §2三氧化二砷與維生素C聯(lián)用

4、對肝癌細(xì)胞抗氧化物質(zhì)的影響 用化學(xué)顯色法檢測細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽(GSH)的活性。 2.0μmol/LAs2O3、100μmol/LAA聯(lián)合作用24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著降低(P＜0.05)，由正常對照組78.73±15.22u/mgpr降低到42.58±17.37u/mgpr，但較單用2.0μmol/LAs2O3組43.85±11.28u/mgpr無顯著

5、性差異(P＞0.05)。 聯(lián)用組作用24小時(shí)后，HepG2細(xì)胞內(nèi)GPx活性也從正常對照組的5.78±1.59u下降到0.58±0.75u(P＜0.01)，但聯(lián)用組和As2O3單用組GPx活性無顯著差異(P＞0.05)。 單用2.0μmol/LAs2O3組、單用100μmol/LAA組和聯(lián)用組孵育細(xì)胞24小時(shí)后，對細(xì)胞內(nèi)GSH活性均有顯著影響。分別從正常對照組的135.22±5.30mg/gpr下降到101.30±5.76

6、mg/gpr(P＜0.01)、76.10±13.48mg/gpr(P＜0.05)和81.91±3.12mg/gpr(P＜0.01)。且聯(lián)用組較單用As2O3組有顯著性差異(P＜0.05)。 第二部分三氧化二砷與維生素C聯(lián)用對肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 用羅丹明123標(biāo)記線粒體，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，觀察As2O3和AA對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響。 作用于細(xì)胞24小時(shí)后，單用As2O3組和聯(lián)用組均顯著

7、降低線粒體膜電位(P＜0.01)，且聯(lián)用組膜電位顯著低于As2O3單用組(P＜0.01)。AA單用組對線粒體膜電位無顯著性影響(P＞0.05)。 第三部分三氧化二砷與維生素C聯(lián)用對肝癌細(xì)胞凋亡蛋白的影響 WesternBlot法檢測As2O3與AA聯(lián)用24小時(shí)后對HepG2細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的影響。 §1三氧化二砷與維生素C聯(lián)用對Caspase-3蛋白的影響 單用As2O3組和

8、聯(lián)用組均顯著激活Caspase-3蛋白(P＜0.01)，且聯(lián)用組激活的Caspase-3蛋白量顯著高于As2O3單用組(P＜0.01)。 §2三氧化二砷與維生素C聯(lián)用對細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白量比值的影響 單用As2O3組和聯(lián)用組均顯著降低Bcl-2/Bax蛋白量比值(P＜0.01)，但聯(lián)用組與As2O3單用組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 第四部分抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對三氧化二砷和維生素C聯(lián)合作用的影

9、響§1NAC對As2O3+AA聯(lián)用組細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響 用流式細(xì)胞儀檢測裝載在細(xì)胞內(nèi)活性氧探針的熒光強(qiáng)度，觀察NAC作用前后聯(lián)用組HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。 10mmol/LNAC使聯(lián)用組ROS含量降低(P＜0.05)。 §2NAC對As2O3+AA聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率的影響 10mmol/LNAC使聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率從16.06％±0.86％下降到9.48％±0.67％(P＜0.05)。 結(jié)論