鼠尾草酸聯(lián)合三氧化二砷誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的體內(nèi)體外研究.pdf

1、目的：急性髓系白血病(AML)是一種造血系統(tǒng)細(xì)胞異常增殖的惡性血液腫瘤。其發(fā)生和發(fā)展與白血病細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。細(xì)胞具有增殖、分化和凋亡三方面的特征，在維持正常組織的生長平衡過程中三者互相協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)。一旦細(xì)胞凋亡受阻，打破細(xì)胞的平衡調(diào)節(jié)，造成明顯的生長優(yōu)勢，就為腫瘤的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。因此誘導(dǎo)凋亡療法是目前治療白血病的最重要方法之一.三氧化二砷(As2O3)作為經(jīng)典的凋亡誘導(dǎo)劑，不僅可使初治的APL患者有較高完全緩解率，對全反式維甲酸

2、和化療耐受的復(fù)發(fā)患者及其他類型的白血病也有良好的治療作用，并且不會導(dǎo)致骨髓抑制。但是其毒副作用在一定程度上限制了AS2O3在臨床的應(yīng)用。有研究表明As2O3的毒性呈劑量依賴性，因此，尋找少毒副作用增敏劑，與As2O3聯(lián)合應(yīng)用，增強(qiáng)其誘導(dǎo)凋亡的作用，降低其使用劑量，減輕其毒副作用，是拓寬As2O3臨床應(yīng)用范圍的重要手段。鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)是迷迭香提取物中的抗氧化多酚，作為無毒防腐添加劑，廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)。研

3、究發(fā)現(xiàn)CA具有多種藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗血栓、抗炎等。近年來，最新研究證實CA能夠增強(qiáng)全反式維甲酸和維生素D衍生物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的能力CA在體內(nèi)和體外是否具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的能力?CA與As2O3聯(lián)合是否具有協(xié)同作用?其內(nèi)在的分子機(jī)制又是什么?針對上述問題，本實驗著重探討CA自身及聯(lián)合As2O3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞(人急性髓系白血病細(xì)胞株)及人白血病小鼠模型體內(nèi)白血病細(xì)胞凋亡的作用，并采用各種分子生物學(xué)技術(shù)，研究其內(nèi)在的分

4、子機(jī)制。 方法：1、體外實驗：選用人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞為研究對象，CA自身及聯(lián)合As2O3作用，采用臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，觀察藥物對細(xì)胞生長情況的影響；用MTT法檢測細(xì)胞活性的改變；瑞氏一吉姆薩染色觀察藥物作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；碘化丙錠(PI)染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期改變；AnnexinV/FITC和PI染色計算細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)蛋白cas

5、pase-9、BAD、p-BAD、p27、PTEN、Akt、p-Akt的表達(dá)；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測PTEN mRNA的表達(dá)。 2、體內(nèi)實驗：(1)HL-60/SCID小鼠動物模型的建立及鑒定：選取5周齡的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，鼠尾靜脈注射對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞1×107個，建立HL-60/SCID小鼠人白血病模型。觀察小鼠的一般情況及生存時間；每周檢查血常規(guī)，進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)及血涂片檢測：取

6、瀕死小鼠的腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結(jié)腫塊，進(jìn)行組織病理學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢測；取瀕死小鼠的骨髓細(xì)胞制成染色體標(biāo)本，應(yīng)用G顯帶法進(jìn)行染色體核型分析。(2)劑量-效應(yīng)實驗：取接種1周后的SCID小鼠，隨機(jī)分為3組，每天分別給與CA 200mg/Kg、300mg/Kg、500mg/Kg，i.g.，治療4周后記錄生存時間。(3)CA自身及與As2O3聯(lián)合治療HL-60/SCID小鼠的療效觀察：取接種1周后的SCID小鼠，隨機(jī)分為4組：①對照組：每日給

7、與橄欖油，i.g.+生理鹽水，i.p.；②CA組：每日給與CA 500mg/Kg，i.g.+生理鹽水，i.p.；③As2O3組：每日給與橄欖油，i.g.+.As2O,3mg/Kg，i.p.；④CA+As2O3組：每日給與CA 500mg/Kg，i.g.+As2O3 3mg/Kg，i.p.。給藥4周。觀察小鼠的一般情況及生存時間。取接種4周后的SCID小鼠，分組給藥同(3)。給藥10天后處死，取脾細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周

8、期改變和檢測細(xì)胞凋亡率。取小鼠的腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結(jié)腫塊，進(jìn)行組織病理學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢測，免疫組化檢測caspase-3、p27、PTEN的表達(dá)改變。 結(jié)果：1、體外實驗：臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，和MTT法示，CA對HL-60細(xì)胞生長的抑制呈劑量、時間相關(guān)性，并且CA顯著增強(qiáng)As2O3對HL-60細(xì)胞活性的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下觀察可見治療組細(xì)胞有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)。單用CA組、A

9、s2O3組和CM+As2O3組作用48h后，處于G1期的細(xì)胞百分率(％)分別為：49.69±2.66、52.93±2.18和77.59±1.40，CA顯著增強(qiáng)As2O3引起的細(xì)胞G1期停滯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Westrenblot示，與細(xì)胞周期改變一致，聯(lián)合用藥組p27蛋白表達(dá)明顯高于單藥組。表明p27參與了以上藥物引起的G1期停滯。Annexin V-FITC/PI染色法顯示加入15 μ M CA，使得凋亡率(％)從A

10、s2O3組的42.35±2.51上升到CA+As2O3組的75.5±2.45，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明CA能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，其作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)；并且能夠加強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)凋亡的作用。Westren blot示48h后，cleaved caspase-9在15μM CA組，4μM AszO3組和15μM CA+4μMAs2O3組的表達(dá)依次增強(qiáng)，均強(qiáng)于對照組；BAD的表達(dá)沒有明顯變化；p-BAD的表達(dá)依次減弱

11、，均弱于對照組。說明藥物誘導(dǎo)凋亡的作用與激活caspase-9，抑制BAD磷酸化有關(guān)。PTEN蛋白和mRNA的表達(dá)在15 μM CA組，4 μM As2O3組和15μM CA+4μM As2O3組依次增強(qiáng)，均強(qiáng)于對照組。Akt在15μM CA組，4μM As2O3組和15 μM CA+4μM As2O3組的表達(dá)沒有明顯變化；p-Akt的表達(dá)依次減弱，均弱于對照組。提示CA、As2O3能夠促進(jìn)PTEN的表達(dá)，抑制Akt的磷酸化。 2、體內(nèi)

12、實驗：(1)HL-60/SCID小鼠動物模型的建立及鑒定：接種后14天外周血涂片可見HL-60細(xì)胞，發(fā)病晚期瀕死小鼠白細(xì)胞計數(shù)數(shù)倍于正常，血涂片中HL-60細(xì)胞可占90％。白細(xì)胞計數(shù)第14、21、和28天WBC(109/L)分別為3.9±1.2、5.4±0.7和16.1±3.9。生存期為24-32天。取瀕死小鼠解剖后，可見肝、脾、腎、睪丸腫大，并且肝、脾、腎及腹膜彌漫存在粟粒樣白色結(jié)節(jié)(白血病細(xì)胞浸潤)，頸項、四肢、眼、淋巴結(jié)可見腫塊。

13、腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結(jié)腫塊組織病理切片和細(xì)胞涂片顯示有大量白血病細(xì)胞浸潤。染色體核型分析示動物體內(nèi)白血病細(xì)胞與體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞染色體核型一致。(2)劑量-效應(yīng)實驗：經(jīng)過4周治療后，生存期(天)分別為：200mg/Kg：34.9±3.28，300mg/Kg42.6±5.82，500mg/Kg：47.0±6.17，提示小鼠生存期呈劑量相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)CA自身及與As2O3聯(lián)合治療HL-60/SC

14、ID小鼠的療效觀察：經(jīng)過4周治療后，生存期(天)分別為：對照組：27.0±2.49，CA組：50.8±3.12，As2O3組：62.2±2.66，CA+As2O3。組：80.1±5.02，提示與單藥相比，CA和As2O3聯(lián)合生存期明顯延長(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞停滯在G1期的細(xì)胞百分率(％)為：對照組：36.0±4.53，CA組：46.4±6.47，As2O3組：51.0±3.54，CA+As2O3組：75.2±8.53，說

15、明CA顯著增強(qiáng)As2O3引起的細(xì)胞G1期停滯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析藥物引起的細(xì)胞凋亡率(％)分別為：對照組：4.8±1.79，CA組：13.2±3.19，As2O3組：58.2±5.97，CA+As2O3組：76.2±4.87，CA能夠促進(jìn)As2O3誘導(dǎo)凋亡的能力(P＜0.05)。組織病理切片和細(xì)胞涂片示：對照組可見大量的白血病細(xì)胞成團(tuán)聚集，治療組均可見不同數(shù)量的凋亡的白血病細(xì)胞。免疫組化示：聯(lián)合用藥組cas

16、pase-3、p27、PTEN的表達(dá)均高于單藥組。 結(jié)論：CA在體外實驗中能夠抑制HL-60細(xì)胞的增殖，具有一定的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯的能力，并且呈時間、劑量依賴性。在體內(nèi)實驗中，CA亦能引起HL-60細(xì)胞凋亡，并能夠延長白血病小鼠的生存時間，呈劑量依賴性。更為重要的是，CA與As2O3聯(lián)合應(yīng)用，不但能夠在體外顯著增加白血病細(xì)胞的凋亡率，引起細(xì)胞周期阻滯于G1期，并且在體內(nèi)也能顯著增強(qiáng)上述作用，并能顯著延長小鼠生存時間。其

17、協(xié)同效果明顯高于單藥組。 在誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)CA自身及聯(lián)合As2O3，在體外能促進(jìn)p27的表達(dá)，激活caspase-9，抑制BAD的磷酸化。且PTEN/Akt信號通路亦參與了各藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯。在體內(nèi)研究中，CA自身及聯(lián)合As2O3能夠活化caspase-3，增強(qiáng)PTEN、p27的表達(dá)。 綜上所述，體內(nèi)、體外實驗證明CA能夠增強(qiáng)As2O3抗白血病的作用，使得應(yīng)用較小劑量的As2O3就能