miR-149-5p抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、[背景和目的]
　　 作為20世紀末生命科學領域的重大發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)已迅速成為了多個學科的研究熱點。研究表明，這種保守的、非編碼的、內(nèi)源性單鏈小RNA分子，通過與靶mRNA特定序列的結(jié)合調(diào)控基因的表達，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的過程中起著起著癌基因(oncomiRNAs)或抑癌基因(tumor suppressor miRNAs)的作用。
　　 在世界上肝癌發(fā)病率最高的國家中，我國即為其一，每年

2、大約有11萬例患者因肝癌而死亡。其中，肝細胞癌(以下簡稱肝癌，hepatocellular carcinoma，HCC)又在原發(fā)性肝癌中占85-90%，為其最多見的組織學分型。肝癌預后差，肝癌轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者療效和獲得長期生存的關鍵問題，其確切的機制仍不清楚，現(xiàn)仍缺乏早期診斷和有效治療的方法。雖然目前醫(yī)學已經(jīng)取得極大進步，但其5年生存率仍很低，復發(fā)和轉(zhuǎn)移常見。因此，通過研究miRNA在肝癌中的作用，可進一步闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制，

3、從而為肝癌的診治提供新的思路。本研究即從在肝癌中表達失調(diào)的miRNA入手，探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機制。
　　 [方法]
　　 1.采用miRNA基因芯片技術(shù)篩選可能參與調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的miRNA；
　　 2.采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞株中驗證肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA；
　　

4、3.采用qRT-PCR技術(shù)驗證肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA在肝癌及非肝癌患者血漿中的表達；
　　 4.采用qRT-PCR技術(shù)驗證肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA在手術(shù)標本(肝癌和癌旁肝組織)中的表達；
　　 5.分析miRNA與肝癌臨床病理特征、臨床預后的關系。
　　 6.采用qRT-PCR技術(shù)驗證肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA在不同肝癌細胞株及肝癌和癌旁肝組織細胞中的表達；
　　 7.采用慢病毒感染技術(shù)過表達肝癌細胞內(nèi)miRN

5、A的表達水平；
　　 8.采用MTT實驗、流式細胞術(shù)、平板克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗對肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA進行功能分析，觀察該miRNA在體外實驗中對肝癌細胞株的生物學行為會產(chǎn)生什么影響；
　　 9.采用生物信息學技術(shù)預測肝癌轉(zhuǎn)移相關miRNA的靶基因；
　　 10.采用Western blot方法初步驗證miRNA對靶基因的調(diào)控作用；
　　 [結(jié)果]
　　 1.經(jīng)過mi

6、RNA基因芯片技術(shù)的初步篩查，我們發(fā)現(xiàn)：22條miRNA在高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株中表達上調(diào)超過2倍或以上，2條miRNA在高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株中表達下調(diào)超過2倍或以上，進一步qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-149-5p(原名miR-149)、miR-345、miR-193b*、miR-1301等4條miRNA在高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞株中表達差異超過3倍，差異最為明顯的是miR-149-5p；
　　 2.通過qRT-PCR方法檢測miR-14

7、9-5p在肝癌伴(26例)或不伴轉(zhuǎn)移(14例)、肝硬化(3例)、轉(zhuǎn)移性肝癌患者(6例)及正常人(30例)血漿中的含量，發(fā)現(xiàn)血漿miR-149-5p對于肝癌的診斷和鑒別診斷無明顯統(tǒng)計學意義(p<0.05)；
　　 3.通過qRT-PCR方法檢測95對手術(shù)標本(肝癌和癌旁肝組織)中miR-149-5p的表達，發(fā)現(xiàn)miR-149-5p在癌組織中的相對含量顯著低于癌旁肝組織(6.982±1.166vs.12.208±2.461，p<0.

8、05)；
　　 4.進一步分析miR-149-5p在95例肝癌和癌旁肝組織中相對含量的比值(C/P)與性別、年齡、肝炎、AFP、肝硬化、腫瘤大小、多少、分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系，發(fā)現(xiàn)：C/P比值與肝硬化病史顯著相關(p<0.05)；與AFP含量和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關，但無統(tǒng)計學差異(p>0.05)，可能與相應分組樣本量偏少有關；同時，生存曲線分析表明，C/P>1組患者術(shù)后生存時間優(yōu)于C/P<1組，但無統(tǒng)計學差異(p>0.05)，

9、可能與隨訪時間過短有關；
　　 5.通過qRT-PCR方法檢測MHCC97-H、MHCC97-L、Huh-7、SMMC-7721、HepG2、PLC、LO2細胞株與肝癌和癌旁肝組織細胞中miR-149-5p的表達，發(fā)現(xiàn)miR-149-5p在各細胞株及癌組織細胞中的表達低于癌旁肝組織細胞(p<0.01)；
　　 6.通過負載miR-149-5p的慢病毒成功感染MHCC97-H細胞后，MTT實驗表明miR-149-5p過表達

10、可明顯抑制MHCC97-H細胞的增殖能力(p<0.01)，流式細胞術(shù)表明miR-149-5p對MHCC97-H的細胞周期無明顯影響，平板克隆形成實驗表明miR-149-5p過表達可抑制MHCC97-H細胞克隆形成能力(克隆形成率：0.137±0.013vs.0.263±0.018，0.256±0.002，p<0.05)，劃痕實驗表明miR-149-5p過表達可抑制MHCC97-H細胞體外遷移能力(24h劃痕寬度/0h劃痕寬度：0.643

11、±0.036 vs.0.454±0.037，0.469±0.013，p<0.05)，Transwell侵襲實驗表明miR-149-5p過表達可抑制MHCC97-H細胞體外侵襲能力(透膜細胞數(shù)：(71.7±7.3)/視野vs.(133.2±4.5)/視野，(122.3±3.4)/視野，p<0.01)；
　　 7.生物信息學預測miR-149-5p可能調(diào)控的靶基因有67個，其中與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關的基因為轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1(spec

12、ificity protein1，SP1)，WB技術(shù)初步驗證SP1可能是miR-149-5p的靶基因之一。
　　 [結(jié)論]
　　 我們首次發(fā)現(xiàn)miR-149-5p(原名miR-149)在肝癌組織中表達降低，與肝癌患者的預后密切相關，miR-149-5p過表達可以明顯抑制肝癌細胞體外的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-149-5p可能通過調(diào)控其潛在靶基因SP1的表達來抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本課題從miRNA水平初步闡