MiR-218-5p通過(guò)CD44-ROCK通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞侵襲.pdf

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó) OSCC的發(fā)病率約在3.6/10萬(wàn)-8.0/10萬(wàn)人之間。OSCC具有較早的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向，晚期可轉(zhuǎn)移至肺、肝、骨等器官，其五年生存率為50%左右。研究認(rèn)為發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞常位于侵襲前沿（Invasive front），與位于腫瘤主體的細(xì)胞相比，侵襲前沿的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，許多導(dǎo)致腫瘤侵襲的分子事件比如蛋白

2、水解酶的分泌、細(xì)胞增殖活性的增加、血管新生、細(xì)胞間黏附分子的改變等均在侵襲前沿被發(fā)現(xiàn)。因此，辨別并篩選出侵襲前沿細(xì)胞亞群可以使我們更深入地解析腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。在 OSCC侵襲前沿研究方面，以往研究多局限于利用免疫組織化學(xué)染色方法分析侵襲前沿細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）標(biāo)志物的表達(dá)，難以分離獲得這些位于侵襲前沿的癌細(xì)胞，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行深入的

3、分析。因此，在體外模擬 OSCC組織在體內(nèi)的侵襲狀況，分離獲得侵襲前沿的癌細(xì)胞是解決這一問(wèn)題的有效途徑。微流控芯片是一種在微米尺度的空間對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)，與傳統(tǒng)技術(shù)相比較微流控技術(shù)是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞及其微環(huán)境進(jìn)行操控的理想平臺(tái)，它消耗低、通量高、仿生性強(qiáng)，在一定程度上可以取代動(dòng)物模型。本研究以微流控芯片為平臺(tái)分離獲得了侵襲前沿的OSCC細(xì)胞，并深入分析了促進(jìn) OSCC細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)的分子機(jī)制。遺傳和表觀遺傳因素均可調(diào)控腫

4、瘤細(xì)胞的侵襲性，最近研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）可以在表觀遺傳水平調(diào)控腫瘤侵襲。然而，miRNA在OSCC侵襲前沿細(xì)胞的表達(dá)狀況及其促進(jìn)侵襲的機(jī)制目前尚未完全闡明。我們對(duì)在微流控芯片上分離獲得的OSCC侵襲前沿細(xì)胞進(jìn)行small RNA測(cè)序，揭示了miRNA在侵襲前沿細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)，并探究了其調(diào)控分子信號(hào)通路，為闡明 OSCC的侵襲機(jī)制提供一種新的視點(diǎn)。
　　目的：
　　以微流控芯片為平臺(tái)分離獲得 OS

5、CC侵襲前沿細(xì)胞，從表觀遺傳水平探討OSCC侵襲性增強(qiáng)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　本研究采用的OSCC細(xì)胞株為UM-SCC6，采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的微流控芯片及其操作方法分離獲得UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞。具體操作如下：在微流控芯片上利用基質(zhì)膠通道分隔細(xì)胞培養(yǎng)通道和刺激誘導(dǎo)通道，將UM-SCC6接種在細(xì)胞培養(yǎng)通道，采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在刺激誘導(dǎo)通道加入20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，誘導(dǎo)UM-SCC6細(xì)胞的侵襲，將侵襲通過(guò)基質(zhì)膠通道

6、遷移至刺激誘導(dǎo)通道的細(xì)胞采用胰蛋白酶消化后，移到培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。上述誘導(dǎo)步驟連續(xù)重復(fù)3次，最終獲得UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞。采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞遷移能力；采用微流控芯片和Transwell小室考察細(xì)胞侵襲能力；采用細(xì)胞免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)EMT經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá)，如E-鈣粘蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin，Vim）和神經(jīng)鈣粘蛋白（Neural cad

7、herin，N-cadherin）；CCK8增殖實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞的增殖能力。
　　采用Trizol法提取UM-SCC6-M和UM-SCC6的總RNA，送至Novogene公司進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)和質(zhì)量控制，進(jìn)行small RNA測(cè)序分析。在對(duì)獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行基本分析后，對(duì)比 UM-SCC6和 UM-SCC6-M的差異表達(dá) miRNAs，通過(guò)miRanda對(duì)獲得的miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并行 KEGG富集分析。采用realtime PC

8、R分析miRNA的表達(dá)；采用western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)；利用mimic和inhibitor的轉(zhuǎn)染研究miRNA的功能，利用Western blot和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確定miRNA對(duì)CD44的調(diào)控作用和直接結(jié)合。利用ROCK蛋白的抑制劑Y27632來(lái)檢測(cè)miR-218-5p對(duì)細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用與CD44-ROCK通路的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　基于微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)、分離，我們獲得了UM-SCC6侵襲前沿細(xì)胞，

9、命名為UM-SCC6-M。不同于UM-SCC6的“鋪路石”樣，UM-SCC-M細(xì)胞之間連接較為松散，部分細(xì)胞形態(tài)呈類似成纖維細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)形，有的具有長(zhǎng)長(zhǎng)的“偽足”，有的細(xì)胞呈“多角形”，形態(tài)學(xué)上UM-SCC6-M具有間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M具有比UM-SCC6強(qiáng)的遷移能力。在侵襲前沿微流控芯片體外模型中，經(jīng)過(guò)24、48、72和96小時(shí)的血清誘導(dǎo)，UM-SCC6-M侵襲入基質(zhì)膠中的高度和面積比 UM-SCC6顯著增加。

10、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M侵襲過(guò)Matrigel膠膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。免疫熒光染色和Western blot表明 E-cadherin蛋白水平在 UM-SCC6-M顯著降低，而 Vim和 N-cadherin則顯著增高。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)顯示UM-SCC6-M的增殖能力與UM-SCC6相比較沒(méi)有顯著變化。因此，我們分離獲得了OSCC侵襲前沿細(xì)胞UM-SCC6-M，并證明其具有間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)和較強(qiáng)的侵襲能力。

11、　　通過(guò)small RNA測(cè)序及分析，我們獲得了44個(gè)UM-SCC6和UM-SCC6-M表達(dá)差異的miRNA，其中27個(gè)在 UM-SCC6-M中表達(dá)降低。我們對(duì) miRNAs靶基因的富集通路進(jìn)行KEGG富集，發(fā)現(xiàn)這些miRNA調(diào)控許多腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，最為顯著的是癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）信號(hào)通路。因此，我們將研究重點(diǎn)放到了影響腫瘤轉(zhuǎn)移的CD44信號(hào)通路。
　　Realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

12、示CD44的mRNA在UM-SCC6-M中的表達(dá)水平與UM-SCC6相似，western blot結(jié)果顯示CD44蛋白在UM-SCC6-M中的表達(dá)水平高于UM-SCC6，提示miRNA可能調(diào)控了CD44在UM-SCC6-M中的表達(dá)。Small RNA測(cè)序結(jié)果顯示miR-218-5p在UM-SCC6-M的表達(dá)水平下降，realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。通過(guò)miRanda預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-218-5p在CD44的mRNA上有

13、結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了miR-218-5p對(duì)CD44的mRNA的3’UTR區(qū)域的直接結(jié)合和調(diào)控作用，提示miR-218-5p調(diào)控的CD44表達(dá)可能在 OSCC侵襲中發(fā)揮一定的作用。我們采用miR-218-5p的mimic和inhibitor干擾miR-218-5p的表達(dá)水平，Western blot顯示miR-218-5p的mimic和inhibitor可以影響CD44蛋白的表達(dá)，基于微流控芯片和Transwell的侵襲實(shí)

14、驗(yàn)均顯示 miR-218-5p的mimic顯著抑制 UM-SCC6-M的侵襲，而 miR-218-5p的inhibitor則顯著促進(jìn)UM-SCC6的侵襲能力，同時(shí)miR-218-5p的inhibitor的促侵襲作用可被CD44下游蛋白R(shí)OCK的inhibitor逆轉(zhuǎn)，證明了miR-218-5p可以調(diào)控CD44-ROCK信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)展了一種基于微流控芯片分離 OSCC侵襲前沿細(xì)胞的方法，分離獲得了具有部分