miR-590-5p通過抑制PDCD4的表達促進肝癌細胞增殖.pdf

1、研究背景:肝細胞癌(HCC)，簡稱肝癌，是目前發(fā)病率、死亡率較高的惡性腫瘤之一。在我國，肝癌是最常見及預后最差的惡性腫瘤，死亡率約為20.4/10萬，占我國全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8％，居第二位。所以對肝癌發(fā)生發(fā)展機制、預后診斷等內(nèi)容的研究，一直是腫瘤學研究的熱點。經(jīng)過多年來對肝癌的臨床研究，盡管已在肝癌的發(fā)病機理、分子診斷、預后評估等方面取得較大進展，但肝癌五年生存率仍相對較低。故從研究肝癌相關(guān)基因著手，完善對肝癌發(fā)病機制的系統(tǒng)認

2、識，對闡明肝癌的發(fā)病機理以及開發(fā)出新的診斷、治療手段，具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 小分子RNA(miRNA)是由21-25個非編碼核苷酸組成的微小RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)部分或完全匹配來抑制靶基因的翻譯或降解靶基因的mRNA。通過調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達，microRNA可以介導腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。研究人員在腫瘤之中發(fā)現(xiàn)越來越多基因與表觀遺傳均伴有microRNA的改變，功能學實驗闡明了這些m

3、icroRNAs在腫瘤的生長和發(fā)展中起著促進或抑制的作用。microRNAs介導調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的途徑可能有以下幾種:與抑癌基因結(jié)合的microRNAs過表達或信號放大，與癌基因結(jié)合的microRNAs內(nèi)源性丟失。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與癌癥有著密切的關(guān)系，最近研究人員發(fā)現(xiàn)miR-590-5p（miR-590）在肝癌中高表達，并通過下調(diào)TGF-β RⅡ抑制TGF-β/SMAD信號通路進而調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展。但TGF-β/SMAD信號通路

4、在癌癥發(fā)展的不同時期所起的作用完全相反，在癌癥初期TGF-β/SMAD信號通路抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，而當癌癥發(fā)展到一定階段TGF-β/SMAD信號通路又會促進腫瘤的發(fā)展。這樣就會出現(xiàn)一個問題，在肝癌前期miR-590表達上調(diào)抑制了TGFβ/SMAD信號通路導致肝癌發(fā)生發(fā)展，但在肝癌后期miR-590抑制TGF-β/SMAD信號通路，對肝癌進展會不會有抑制作用呢？因此，肝癌后期miR-590對TGF-β/SMAD信號通路調(diào)控機制不清。研究發(fā)

5、現(xiàn)，miR-590其中一個靶基因——程序性細胞死亡因子4(PDCD4)是一個重要的腫瘤抑制因子。人PDCD4基因定位于10q24，cDNA編碼區(qū)約1.4kb，編碼的蛋白約含469個氨基酸。大量的研究發(fā)現(xiàn)PDCD4基因是一種抑癌基因，通過影響癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移或抗凋亡能力發(fā)揮其抗腫瘤效應。我們知道細胞異常增殖是癌癥的一個主要特征，那由肝細胞異常增殖導致的肝癌，是否與miR-590及其靶基因PDCD4有關(guān)，兩者是如何對肝細胞增殖發(fā)揮調(diào)控作用

6、的，國內(nèi)暫未見相關(guān)報道。
　　 研究目的:通過檢測對比人正常肝細胞株L-02和肝癌細胞株、肝癌組織和癌旁組織中miR-590的表達情況，探討miR-590在肝癌的發(fā)生發(fā)展中是否起著重要作用;結(jié)合術(shù)后隨訪結(jié)果分析miR-590是否影響肝癌患者的預后。采用MTT實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、流式細胞術(shù)、Western Blot、熒光素酶報告系統(tǒng)及生物信息學等方法，從細胞水平及分子水平探討miR-590如何調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，闡明miR-

7、590、PDCD4在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中對細胞增殖的調(diào)控作用，為肝癌診斷、治療新手段的開發(fā)提供實驗參考依據(jù)。
　　 研究方法:1.檢測miR-590在肝癌中的表達情況。主要采用Real-time PCR為檢測手段，分析對比不同樣品中miR-590的表達差異。(1)以12例新鮮肝癌和癌旁組織為實驗對象，分析不同分期的肝癌組織中miR-590的表達情況，觀察miR-590是否與肝癌的惡性程度相關(guān);(2)在64例液氮凍存肝癌組織（南方醫(yī)

8、院）中檢測miR-590的表達水平，按表達量高低分為miR-590高表達組和miR-590低表達組，結(jié)合患者隨訪資料進行生存分析，了解miR-590與病人預后的相關(guān)性;(3)觀察miR-590在正常肝細胞和肝癌細胞中的表達差異。
　　 2.miR-590的生物學功能研究。以miR-590低表達和miR-590高表達的肝癌細胞株為實驗模型，分別在兩株肝癌細胞株上高表達miR-590和抑制miR-590表達，檢測肝細胞的增殖與miR

9、-590的表達量相關(guān)性。(1)利用MTT實驗檢測不同方法處理后肝癌細胞生長、存活情況;(2)利用軟瓊脂克隆形成實驗檢測不同方法處理后肝癌細胞的增殖能力變化;(3)利用流式細胞術(shù)檢測不同方法處理后肝癌細胞在增殖時發(fā)生的細胞周期變化。
　　 3.研究miR-590是否直接結(jié)合PDCD4的3'UTR而抑制其蛋白翻譯。(1)生物信息學分析miR-590靶基因的結(jié)合位點，篩選出候選靶基因PDCD4;(2)在miR-590的高、低表達組中分

10、別選擇MHCC97H、MHCC97L為實驗對象，分別轉(zhuǎn)染miR-590-inhibitor及miR-590，采用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后PDCD4蛋白表達量的變化，檢驗PDCD4的表達是否受miR-590的表達變化影響;(3)采用熒光素酶報告系統(tǒng)，在上述實驗的基礎(chǔ)上，更進一步地探討miR-590是否直接與PDCD4的3'UTR結(jié)合抑制PDCD4的蛋白翻譯。
　　 4.PDCD4對肝癌細胞增殖功能影響的重要性研究。

11、(1)對MHCC97L分別轉(zhuǎn)染miR-590、miR-590+PDCD4及miR-590+PDCD4-3' UTR，用克隆形成實驗檢測細胞增殖情況，檢驗PDCD4是否可以阻斷miR-590對肝癌細胞增殖的促進功能，并進一步檢驗PDCD4是否受miR-590調(diào)控抑制;(2) Western blot技術(shù)檢測7株肝細胞（1株正常肝細胞LO-2和6株肝癌細胞）中PDCD4的表達水平，結(jié)合之前檢測各株肝細胞中miR-590的表達，分析肝癌細胞中

12、miR-590的表達與PDCD4的表相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.miR-590在肝癌中高表達并對患者預后帶來不良影響。(1)熒光定量PCR實驗檢測12對肝癌組織和癌旁組織的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590在肝癌組織中高表達;(2)熒光定量PCR實驗檢測64例帶有術(shù)后隨訪資料的冰凍肝癌組織樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590高表達預示較差的預后和更高的預后風險(p＜0.01);(3)熒光定量PCR實驗檢測對比正常肝細胞株和肝

13、癌細胞株中miR-590的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590在肝癌細胞系中高表達(p＜0.05)。
　　 2.miR-590影響肝癌的增殖。(1)用MTT法檢測6株肝癌細胞系HepG2、MHCC97L、BEL-7402、MHCC97H、Huh7和Hep3B及一株正常肝細胞系LO-2的生長、存活情況，分析miR-590的表達與肝細胞存活的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590的表達與肝細胞的存活率正相關(guān);(2)在6株肝癌細胞系中選擇miR-5

14、90表達量最低的MHCC97L及miR-590表達量最高的MHCC97H作為細胞模型，分別以MTT法、克隆形成實驗檢測高表達miR-590對MHCC97L和下調(diào)miR-590表達對MHCC97H的增殖影響，流式細胞周期實驗分別檢測高表達miR-590和下調(diào)miR-590表達對肝癌細胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達miR-590可以促進肝癌細胞的增殖，下調(diào)miR-590的表達可以抑制肝癌細胞增殖。
　　 3.miR-590直接調(diào)控PD

15、CD4的翻譯表達。(1)從Target Scan和PicTar對miR-590的target基因進行預測，顯示miR-590可以強結(jié)合PDCD4的3'UTR;(2)使用Western Blot的方法檢驗MHCC97L-NC、MHCC97L-miR-590、MHCC97H-NC和MHCC97H-miR-590-in中PDCD4蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-590與肝癌細胞中PDCD4蛋白的表達負相關(guān);(3)熒光素酶報告結(jié)果:轉(zhuǎn)染miR-59

16、0 mimic后熒光素酶的表達被抑制并存在劑量效應;而當miR-590的表達被抑制后，熒光素酶的表達增強(p＜0.05)，其效果與miR-590 inhibitor的劑量正相關(guān);miR-590與PDCD4的結(jié)合位點被突變后，熒光素酶的表達和對照組沒明顯區(qū)別。
　　 4.PDCD4在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。(1)克隆形成實驗結(jié)果表明PDCD4基因的過表達可以抑制miR-590高表達在肝癌中促進增殖的生物學功能;(2)結(jié)合熒光

17、定量PCR和Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細胞中PDCD4與miR-590的表達負相關(guān)（r=-0.617，p＜0.05)。
　　 結(jié)論:miR-590在肝癌中高表達并且與肝癌惡性程度正相關(guān)，與患者生存時間負相關(guān);miR-590的表達和肝癌細胞的增殖能力正相關(guān);miR-590通過和PDCD4 mRNA的3'UTR結(jié)合抑制其翻譯表達;高表達PDCD4可以抑制miR-590在肝細胞中促增殖的能力;PDCD4和miR-590在肝細胞