miR-429通過靶向調節(jié)TRAF6表達抑制肝癌細胞増殖的研究.pdf

1、目的：肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的90％以上，是世界上腫瘤死亡的主要原因之一，我國原發(fā)性肝癌的發(fā)病率、死亡率均占全世界的50%以上，提高肝癌的早期診斷率和進一步開發(fā)治療肝癌的有效藥物，對于改善肝癌患者的預后和生活質量是非常有必要；miRNA異常表達于各種惡性腫瘤中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關；當前研究顯示 miR-429在不同腫瘤中

2、的表達水平和作用有明顯差異，提示miR-429作為一個原癌或抑癌miR，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，對腫瘤的診斷、治療和預后有潛在臨床應用價值；本實驗通過檢測肝癌中 miR-429的表達情況，研究了其對肝癌增殖、遷移的影響，分析其靶基因TRAF6的表達及對肝癌增殖、遷移的影響，通過體內外實驗進一步探究其在調節(jié)肝癌發(fā)生、發(fā)展中的關系。
　　方法：
　　1、臨床標本和肝癌細胞系中采用Real time PCR檢測miR-429的

3、表達情況；
　　2、在體外實驗中，使用miR-429慢病毒和對照組空白慢病毒miR-CON分別轉染肝癌細胞系SK-HEP1，然后采用MTT檢測miR-429對肝癌細胞系增殖能力的影響；利用wound healing和Transwell實驗檢驗miR-429對肝癌細胞系遷移能力的影響；
　　3、運用生物信息學、熒光素酶報告實驗檢測miR-429的靶基因；
　　4、采用質粒轉染、回復實驗檢測miR-429與TRAF6的相互

4、調控關系，采用免疫熒光、Western blot檢測miR-429在調控肝癌細胞增殖中的核心信號通路；
　　5、采用裸鼠荷瘤體內實驗檢測miR-429對肝癌細胞增殖的影響。
　　結果：
　　1、通過Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-429在肝癌組織中的表達水平明顯降低，在癌旁組織中miR-429的表達水平較肝癌組織增加1.47倍；通過Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常肝細胞HL7702對比，肝癌細胞中

5、miR-429的表達明顯下調，其中SK-HEP1的表達下調最為明顯。
　　2、與轉染空白對照組miR-CON相比，miR-429抑制肝細胞系増殖和生長能力（MTT法），提示miR-429可以影響肝癌的增殖能力。為檢測miR-429是否會影響肝癌細胞遷移能力，我們進行了wound healing和Transwell實驗，與對照組相比，SK-HEP1轉染miR-429后愈合率下降到原來的65.52%；Transwell實驗結果類似，與

6、對照組相比，SK-HEP1轉染miR-429后遷移能力下降到原來的45.67%。以上的結果顯示，miR-429在肝癌細胞系中對腫瘤細胞的增殖、遷移能力具有明顯的抑制作用。
　　3、采用熒光素酶報告基因檢測肝癌中TRAF6是miR-429的靶基因。與突變型載體 TRAF6-3’UTR-MUT相比，TRAF6-3’UTR-WT轉染細胞的熒光信號值僅為對照的0.52；與空白載體相比，轉染TRAF6-3’UTR-WT野生型的細胞中的熒光信

7、號值沒有發(fā)生變化。以上結果顯示，miR-429通過與野生型載體中的結合位點相結合，誘導了載體的降解并降低了熒光信號的釋放。我們進一步通過Western blot檢測了miR-429對TRAF6蛋白表達的影響：與轉染空白載體的肝癌細胞相比，轉染miR-429的細胞TRAF6蛋白的表達明顯降低。因此，在肝癌細胞中表達増加的miR-429可以有效降低TRAF6蛋白質表達水平。TRAF6在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織中的表達，miR-4

8、29在肝癌組織中的表達明顯下調，提示 miR-429在肝癌中可能作為抑癌因子存在，miR-429對肝癌腫瘤細胞増殖和侵襲的抑制作用可被TRAF6的髙表達逆轉，TRAF6是miR-429的靶基因。
　　4、在經過免疫組織化學檢測后發(fā)現(xiàn)，TRAF6蛋白質在肝癌中呈明顯的過度表達（P＜0.01）。TRAF6主要是細胞質著色為主，僅有散在的細胞核著色，其中強表達病例數(shù)高這80%（20/25）。為檢測TRAF6蛋白的表達増加是否可以逆轉mi

9、R-429的腫瘤抑制作用，我們首先使用 siTRAF6轉染了 HCCLM3細胞系，與對照組相比較，siTRAF6組的細胞增殖能力、遷移能力受到了明顯的抑制；但是當該組細胞轉染了anti-miR-429后，其對肝癌細胞的增殖和遷移能力得到了明顯的抑制，與對照組相比，無統(tǒng)計學差異。在體外細胞系中，我們將 HCC細胞感染了 LV-miR-429，然后采用免疫熒光檢測P65的表達，結果顯示P65明顯的分布于細胞質，而經pcDNA-TRAF6轉染

10、后，P65再次聚集于細胞核內。該結果表明miR-429在調控NF-kB信號通路中起著重要的作用。miR-429轉染HCC細胞后會導致pTAK1，cMyc和TRAF6表達的降低，而將該組重新轉染pcDNA-TRAF6后，發(fā)現(xiàn)pTAK1，cMyc和TRAF6表達恢復到與對照組一致，該結果說明TRAF6表達的增加可抵消miR-429對HCC細胞系NF-kB信號通路分子的影響。綜合以上結果表明：miR-429通過調控TRAF6的表達經由NF-k

11、B信號通路發(fā)揮其生物學效應。
　　5、我們也在體內環(huán)境下利用裸鼠模型檢測了miR-429對肝癌腫瘤生長的作用。結果顯示與對照miR-CON轉染細胞的皮下種植瘤模型相比，miR-429轉染的皮下種植瘤的生長明顯受到了抑制。在注射腫瘤細胞24天后，轉染miR-429的腫瘤平均體積為對照組腫瘤體積的53.39%。通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)TRAF6和P65的表達明顯降低。因此，miR-429轉染肝癌細胞后可在體內和體外實驗中顯著降低腫瘤細胞的