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文檔簡介
1、肝細胞肝癌(肝癌)是肝臟中首要的惡性腫瘤。在全球惡性腫瘤死亡率排行榜中,肝癌排名第三。在很多國家,肝癌的發(fā)病率和死亡率仍在不斷升高。由于早期診斷困難,缺乏有效的治療措施,肝癌患者總體預后很差。近年來,一些重要的信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用得以闡明,多蛋白激酶抑制劑—索拉菲尼也已經(jīng)被批準用于肝癌的治療。然而,肝癌早期診斷難,晚期治療效果差的現(xiàn)狀仍然沒有被改變。因此,深入理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找新的診治靶點迫在眉睫。microRN
2、A是一類長度為17~25個核苷酸的單鏈非編碼 RNA。大量研究表明, microRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。我們對肝癌相關(guān)microRNA的文獻進行檢索和分析,發(fā)現(xiàn)有兩個研究小組都采用microRNA芯片比較肝癌組織和癌旁組織中microRNA表達差異。這兩個研究小組的結(jié)果都表明,miR-125a在肝癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織。然而miR-125a在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制卻未見報道。
目的:
1.驗證
3、miR-125a在肝癌和癌旁組織中的差異表達,并探討miR-125a表達水平與患者臨床病理資料的相關(guān)性;
2.明確miR-125a對肝癌的惡性表型的調(diào)控作用;
3.闡明miR-125a抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的機制。
方法:
1.采用實時熒光定量PCR檢測miR-125a在80例肝癌及癌旁組織的表達情況,并分析其表達水平和患者臨床指標及預后的關(guān)系;2.構(gòu)建miR-125a的慢病毒載體,感染細胞,建立
4、穩(wěn)定表達miR-125a和對照microRNA的肝癌細胞系。通過MTT實驗,軟瓊脂克隆形成實驗以及裸鼠皮下成瘤實驗,檢測miR-125a對肝癌細胞增殖的影響;3.通過Transwell侵襲實驗以及裸鼠尾靜脈注射實驗,檢測miR-125a對肝癌細胞遷移轉(zhuǎn)移的影響;4.運用MTT和Transwell實驗,采用miR-125a的抑制劑,檢測下調(diào)內(nèi)源性miR-125a對肝癌細胞增殖及侵襲的影響;5.采用target gene以及 microrn
5、a文庫等生物信息網(wǎng)站預測miR-125a可能作用的靶基因,并采用雙熒光報告基因?qū)嶒?實時熒光定量PCR實驗以及免疫印跡實驗,進一步的驗證其靶基因;6.采用免疫組化實驗進一步研究靶基因和miR-125a在肝癌及癌旁組織中表達情況,并分析兩者的關(guān)系。
結(jié)果:
1.對80例肝癌及配對癌旁組織標本的檢測結(jié)果表明,和癌旁相比,miR-125a在62例肝癌組織中低表達,占總體樣本的77.5%,癌旁組織和癌組織的平均表達差異為4.
6、72倍。通過對臨床資料的分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-125a在肝癌中的表達差異與肝癌患者較差的預后和發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。
2.通過感染帶有miR-125a和對照microRNA的慢病毒,構(gòu)建成功能穩(wěn)定提高miR-125a表達的細胞系,MTT結(jié)果顯示:過表達miR-125a肝癌細胞的生長能力在第四天開始受到抑制。其增殖能力明顯低于對照microRNA及親本細胞。軟瓊脂克隆形成實驗表明,與對照和親本細胞相比,過表達miR-125a的肝癌細胞得
7、到更少和更小的克隆。通過裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn),過表達miR-125a細胞組形成的腫瘤更小。
3.過表達miR125a能顯著抑制肝癌細胞體外的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。和體外實驗相一致,動物實驗結(jié)果表明,注射表達對照micoRNA的肝癌細胞到裸鼠體內(nèi)形成了顯著的肝肺轉(zhuǎn)移灶,而注射miR-125a過表達肝癌細胞的小鼠則只有較少的轉(zhuǎn)移灶形成。
4.通過MTT和Transwell實驗,我們發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)miR-125a會顯著提高肝癌細胞
8、的增殖和轉(zhuǎn)移能力。
5.通過雙熒光素酶基因報告系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)miR-125a可以顯著降低含有MMP11和VEGF3‘UTR的報告基因載體的熒光素酶的活性。提示MMP11及VEGF可能為miR-125a的靶基因。qRT-PCR結(jié)果表明miR-125a可以顯著下調(diào)VEGF和MMP11的mRNA水平。Western blot在細胞蛋白水平證實了這一結(jié)果。
6.為了進一步研究miR-125a和MMP11,VEGF在肝癌患者組
9、織中的表達情況,我們采用了免疫組化的方法檢測了MMP11和VEGF在此前用到的80對肝癌患者組織中的表達情況。通過spearman統(tǒng)計學分析,發(fā)現(xiàn)miR-125a的表達和MMP11,VEGF的表達呈負相關(guān)。
結(jié)論:
1. miR-125a在肝癌組織中的表達明顯低于配對的癌旁組織, miR-125a與肝癌的惡性表型顯著相關(guān);
2.過表達miR-125a能顯著抑制肝癌細胞體內(nèi)外的增殖和轉(zhuǎn)移能力;
3.
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