miR-10b通過抑制CADM1表達(dá)促進(jìn)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,肝癌)是世界發(fā)病率第5位的常見腫瘤,是世界第3位、我國第2位的腫瘤致死原因,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。肝癌高死亡率的原因在于肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,由于其確切的機制仍不清楚,目前仍然缺乏有效的預(yù)防和治療的手段。因此研究肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制并采取有效的預(yù)防治療措施是提高肝癌患者療效、改善肝癌患者預(yù)后的突破口。
　　MircoRNAs(miRNA

2、s)是一類長度為20-23個堿基、廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA,它們通過與靶基因mRNA的3’-端非翻譯區(qū)(3’UTR)相互作用對其靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等過程。異常表達(dá)的miRNAs與多種疾病,包括惡性腫瘤密切相關(guān),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到癌基因或抑癌基因的作用。近來,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移與miRNAs的關(guān)系越來越多的受到人們的關(guān)注,miRNAs通過調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞黏附、基質(zhì)降

3、解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)、血管生成等相關(guān)的基因的表達(dá)發(fā)揮作用,許多轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs分子已經(jīng)被確認(rèn)。其中miR-10b已被證實在不同的細(xì)胞背景或腫瘤微環(huán)境下,miR-10b發(fā)揮不同的功能,例如,在乳腺癌和食管癌中,miR-10b可以促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,因此miR-10b被稱作促轉(zhuǎn)移因子。在惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中,miR-10b通過阻遏細(xì)胞周期和抑制促凋亡基因,促進(jìn)

4、癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。另外,有研究證實在肝癌干細(xì)胞瘤性轉(zhuǎn)化過程miR-10b表達(dá)上調(diào),提示上調(diào)的miR-10b可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　細(xì)胞粘附分子1(cell adhesion molecule1,CADM1)屬于細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成員,是一種新的腫瘤抑制基因,參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和維持細(xì)胞粘附功能的穩(wěn)定,CADM1表達(dá)降低或失活與腫瘤的侵襲和不良的預(yù)后相關(guān)。既往研究表明CADM1在許多腫瘤包括肝癌中表達(dá)都是

5、降低的。通過計算機預(yù)測和生物信息學(xué)分析,我們推測CADM1是miR-10b的潛在靶基因之一。
　　但是,miR-10b是否參與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移?miR-10b在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用是否通過調(diào)節(jié)CADM1來實現(xiàn)的?以miR-10b為靶點的干預(yù)是否能有效逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型?這些問題都不清楚,因此,miR-10b在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及作用機制還需進(jìn)一步的研究和探索。
　　目的：
　　探討 miR-10b在肝癌侵襲轉(zhuǎn)

6、移中的調(diào)節(jié)作用及其分子機制,旨在從新的角度闡明肝癌轉(zhuǎn)移的機制,為尋找新的肝癌治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集58例(病理證實手術(shù)時發(fā)生轉(zhuǎn)移36例,未轉(zhuǎn)移22例)肝癌組織和10例正常肝組織標(biāo)本,實時定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測miR-10b表達(dá),分析miR-10b表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。選用不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97H和無轉(zhuǎn)移潛能的正常肝細(xì)胞系

7、HL-7702,qRT-PCR的方法檢測miR-10b表達(dá),分析miR-10b表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力之間的關(guān)系。
　　2.體外觀察miR-10b對肝癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響:將人工合成的miR-10b模擬物(miR-10b mimics)、抑制劑(inhibitors,miR-10b-AS)分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,從而過表達(dá)和抑制肝癌細(xì)胞中 miR-10b的水平,觀察肝癌細(xì)胞的增殖(MTT法)、細(xì)胞周期(流式細(xì)胞儀)、凋亡(流

8、式Annexin V染色法)、遷移(Transwell實驗)、侵襲(Matrigel實驗)等生物學(xué)行為的變化。
　　3.構(gòu)建miR-10b過表達(dá)慢病毒載體,將miR-10b過表達(dá)載體感染肝癌細(xì)胞以上調(diào)miR-10b表達(dá),將這種過表達(dá)miR-10b的肝癌細(xì)胞通過尾靜脈注入裸鼠體內(nèi),通過內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實驗在體內(nèi)觀察miR-10b對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.miR-10b下游靶基因的預(yù)測、驗證及功能研究:利用miRanda和Pi

9、cTar靶基因預(yù)測軟件,綜合分析相關(guān)因素,篩選出miR-10b可能的下游靶基因CADM1。利用熒光素酶報告試驗驗證miR-10b對CADM1的負(fù)性調(diào)控作用。在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-10b后利用qRT-PCR和免疫印跡實驗(western blotting)檢測靶CADM1 mRNA和蛋白水平的改變。利用RNAi技術(shù)降低肝癌細(xì)胞中CADM1的蛋白表達(dá)水平,觀察肝癌細(xì)胞的增殖(MTT法)、遷移(Transwell方法)和侵襲(Mat

10、rigel實驗)、細(xì)胞骨架(免疫熒光染色)等生物學(xué)行為的變化。
　　結(jié)果：
　　1.肝癌組織中miR-10b的表達(dá):與正常肝組織對比,轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組的肝癌組織中miR-10b表達(dá)水平均有一定程度的上調(diào),然而,在轉(zhuǎn)移組肝癌組織中miR-10b表達(dá)水平上調(diào)程度尤為明顯(P﹤0.05)。
　　2.miR-10b的表達(dá)水平與肝癌臨床病理參數(shù)的分析結(jié)果表明:miR-10b表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移(P﹤0.01)、AJCC分期(p=0.0

11、16)明顯相關(guān),而與年齡、性別、乙肝、肝硬化、腫瘤大小、數(shù)目及分化無明顯相關(guān);miR-10b的高表達(dá)提示肝癌預(yù)后不良(P﹤0.01),并且是影響肝癌患者總體生存的獨立風(fēng)險因素(p=0.016)。
　　3.不同細(xì)胞系miR-10b的表達(dá)及其與遷移、侵襲能力的關(guān)系:與正常肝細(xì)胞系HL-7702相比,肝癌細(xì)胞系中 miR-10b表達(dá)水平均有一定程度的上調(diào),且 miR-10b表達(dá)水平與細(xì)胞的遷移、侵襲能力均顯著相關(guān)(r=0.65,r=0.

12、71)。
　　4.在體外miR-10b對肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲有明顯的促進(jìn)作用,且能影響細(xì)胞骨架的重組,但對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡無明顯影響。
　　5.體內(nèi)試驗顯示過表達(dá)miR-10b后肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力明顯提高。
　　6.生物信息學(xué)預(yù)測提示,CADM1可能是miR-10b的靶基因之一,熒光素酶報告實驗證實 miR-10b可以抑制含有其結(jié)合位點的螢光報告基因的活性,而對突變體及對照質(zhì)粒沒有影響。過表達(dá)或抑制miR-10

13、b對CADM1 mRNA水平無明顯影響,但卻對其蛋白水平有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。用siRNA下調(diào)CADM1的表達(dá),也能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲、影響細(xì)胞骨架的重組,與 miR-10b過表達(dá)相似的效果。從而證實了miR-10b通過轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控CADM1參與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.miR-10b在肝癌組織尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織及高侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞中明顯上調(diào),提示miR-10b在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到促癌