miR-152抑制Wnt10b影響人正常肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　發(fā)現(xiàn)miR-152在肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用;驗(yàn)證WNT是miR-152靶基因并進(jìn)一步探討miR-152抑制WNT信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制。
　　方法
　　首先，利用慢病毒技術(shù)，構(gòu)建miR-152過(guò)表達(dá)慢病毒和miR-152沉默慢病毒，分別轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞中，得到miR-152過(guò)表達(dá)組細(xì)胞(Lenti-miR-152)、miR-152沉默組細(xì)胞(Lenti-152-In)和空載對(duì)照組細(xì)

2、胞(Lenti-NC)，RT-PCR驗(yàn)證miR-152表達(dá);棕櫚酸和油酸（1mM）干預(yù)Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC組細(xì)胞后，采用油紅O染色和甘油三酯測(cè)定試劑盒檢測(cè)脂質(zhì)合成情況;同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果驗(yàn)證miR-152靶基因;對(duì)Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)WNT信號(hào)通路以及下游脂質(zhì)合成關(guān)鍵

3、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，探討miR-152通過(guò)抑制WNT信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制。最后分別檢測(cè)Lenti-miR-152、Lenti-152-In和Lenti-NC組細(xì)胞ATP含量和線粒體拷貝數(shù)，探討miR-152對(duì)線粒體功能的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR驗(yàn)證miR-152表達(dá)證實(shí)成功構(gòu)建miR-152過(guò)表達(dá)和miR-152沉默肝細(xì)胞。油紅O染色結(jié)果顯示miR-152促進(jìn)肝細(xì)胞脂滴聚積;miR-152過(guò)表

4、達(dá)組細(xì)胞甘油三酯含量高于空載組;miR-152沉默對(duì)肝細(xì)胞脂肪代謝影響不大。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Wnt10b是miR-152的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果證實(shí)miR-152直接結(jié)合于Wnt10b的3'UTR區(qū);同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示miR-152能直接抑制Wnt10b的表達(dá)。RT-PCR與Western blot顯示miR-152增加GSK-3β磷酸化水平，促進(jìn)β-Catenin降解，抑制β-Catenin進(jìn)入肝